链霉菌原生质体融合技术

摘要：原生质体融合技术现在仍然是一种普遍使用的技术，在微生物中链霉菌是一类应用非常广泛的微生物如制药，化工等。所以对于链霉菌的菌种改良是是十分必要的。使用原生质体融合方法对链霉菌进行处理效果十分理想。

关键词：链霉菌 原生质体融合

微生物育种作为一门应用科学技术，一直在发酵工业中倍受人们关注。在现酵工业生产中，所有的原始菌种均需采用育种技术进行改良，以大幅度地提高发酵生产的效率，降低发酵生产的成本，通过诱变与细胞融合技术相结合，对微生物细胞进行基因组重组，从而大幅度提高微生物细胞的正向突变频率及正向突变速度，使得人们能够在较短的时间内获得高效的正向突变的菌株，而受到人们极大的关注。

目前已知的微生物来源的抗菌素6500 余种， 60-70%左右是链霉菌产生的。利用链霉菌原生质体融合不仅克服了种、属间杂交的“ 不育性”， 大大提高了基因间重组的频率， 促进了遗传学研究， 提高了农用抗生素的产量， 并能产生新的抗生素类型。

一 原生质体融合方法和机制

灭活原生质体融合技术是指采用热、紫外线、电离辐射以及某些生化试剂，抗生素等作为灭活剂处理单一亲株的原生质体，使之失去再生的能力，经细胞融合后，由于损伤部位的互补可以形成能再生的融合体。双亲都用加热灭活的原生质体间不能进行融合重组，这可能是由于热作用造成的损伤相似而不能通过融合得以互补，故不能获得融合子。紫外线作用于DNA，其作用靶位较多且分散，不同的损伤位点之间可以互补，因此能形成融合子

目前应用最多的诱导原生质体融合的方法是聚乙二醇（PEG）法。PEG诱导原生质体融合的机制为：PEG以一种分子桥的形式沟通了相邻的质膜；PEG改变了膜的通透性；PEG降低了质膜表面的势能；PEG使质膜中镶嵌的蛋白颗粒凝聚，出现了容易融合的无蛋白质颗粒的磷脂双层区域。

二 链霉菌的原生质体融合育种

与细菌相似，链霉菌原生质体制备可使用溶菌酶，但有些种链霉菌对溶菌酶不敏感，可采用在甘氨酸存在下培养，以改变其敏感性。再生受到多种因素

的影响，培养基中无机盐要求 KH2PO4 低浓度（0.005%），Ca2+ Mg2+高浓度（分别为 20―50mmol/L）蔗糖 10%―15%，其它高渗稳定剂（如 NaCl）不能取

代蔗糖。细胞的生长期对再生也很重要，处于对数期到平衡期的过渡时期的细胞再生效率最高，而处于对数中期或平衡期的原生质体很难再生，少量酪蛋白氨

基酸（0.01%）可加速再生过程，链霉菌原生质体不宜冷贮，贮藏过夜再生能力丧失 98%以上。采用原生质体融合获得重组的频率可达 3%―30%，与结合相比

高 104倍以上。

三 融合后筛选稳定的重组体的方法

1 营养缺陷型标记

其原理是缺陷单亲的原生质体丧失了合成某种物质的能力， 在基本培养基上不能萌发生长， 因而， 单亲的原生质体不能长出菌落， 只有双亲原生质体融合后， 缺陷的遗传物质得到互补才能在基本培养基上生长。营养缺陷型标记又分为直接法和间接法。直接法就是把融合液涂到基本培养基上或缺乏双亲生长所必需营养的再生培养基上， 直接选出融合子； 间接法是让亲本和融合子再生， 待长出菌落后， 再将它们点接到选择性培养基上检出重组子。

2 抗药性标记

抗药性是微生物的特性，不同种的微生物对某种药物的抗性存在差异，利用这种差异与菌种其他特性结合起来即可以对菌种进行标记和融合子的选择。抗药

标记的应用基本避免了营养缺陷型标记的不足， 但抗药性的获得， 同营养缺陷性标记一样需要大量时间。同时， 培养基中药物的浓度也要掌握好， 太低或太高都会影响融合子的检出。

3 荧光色素标记法

用不同荧光色素染色双亲原生质， 使其在特定的波长下显现不同的颜色。一般是在酶解液中加入荧光色素， 使双亲原生质体分别带上不同的荧光色素， 带上荧光色素的原生质体仍能发生融合并具有再生能力。原生质体融合处理后， 在荧光显微镜下观察并通过显微操作， 直接选出带有荧光的原生质体（融合子） 。

4 失活原生质体供体法

原生质体经紫外线照射、加热或经某些化学药剂的处理， 可使其丧失在再生培养基上再生的能力， 而只能作为遗传物质的供体。从而只根据另一亲株特性设计选择条件而选择融合子。

5 利用不同的生理生化特点作选择性标记

利用亲本菌株对糖， 纤维素等物质不同需求作为标记， 克服了营养缺陷型， 抗药性等的特点， 而且更适合远缘杂交。

四 原生质体融合技术的优越性

原生质体融合技术。没有细胞壁的阻碍，不需要有已知的遗传系统，融合后两亲株的整套基因组相互接触，使优良性状通过融合再组合到一个新单菌株中。它较传统遗传工程中基因组技术简单易行，定向性强，效率高，在微生物菌种选育中仍具有广泛的应用前景。原生质体融合技术克服了种、属间杂交的不育性，大大提高了基因间重组的频率。目前微生物原生质体融合仍是生物工程中的一项重要内容，也是现阶段最易广泛开展并收到实效的生物工程手段。

参考文献：

[1] [C]PP植物病理学研究进展.北京：中国农业科技出版社，2001.

[2]刘秋.抗真菌生物农药）凯地菌素的研究[D].沈阳农业大学博士学位论文，2002.

[3]于秀莲，何建勇，白秀峰，等.阿维菌素产生菌的诱变育种[J].沈阳药科大学学报，2001，18（6）：429-431.

[4]王晓伟，何建勇，白秀峰.阿维菌素E107异常代谢产物的研究[J].中国抗生素杂志，2004，21（3）：222-225.

[5]刘志恒，姜成林.放线菌现代生物学与生物技术[M].北京：科学出版社，2004.296-299.