氯沙坦通过减少细胞凋亡减轻心肌肥大大鼠的骨骼肌萎缩

作者：付春景，黄幼田，郭龙辉，申琦，汤宁

【关键词】 氯沙坦

Losartan decreases skeletal muscle atrophy in rats with myocardial hypertrophy through reducing cell apoptosis

【Abstract】 AIM: To explore the role of cell apoptosis in skeletal muscle atrophy in rats with myocardial hypertrophy and the effect of losartan on it. METHODS: Fortytwo Sprague Dawley rats were randomly divided into 3 groups: group I (n=14, normal control group), group II (n=14, myocardial hypertrophy group) and group III (n=14, losartan group). Monocrotaline (30 mg/kg) was injected transperitoneally in group II and group III to induce myocardial hypertrophy. After 2 weeks, group III was treated with losartan ［10 mg /(kg・d)］ by gavage. After 2 additional weeks, the rats were killed. Gastrocnemius mass /body mass ratio served as the degree of muscle atrophy. Apoptotic cells in gastrocnemius were stained in situ by using TUNEL. Gastrocnemius Bcl2 and Bax protein were quantified by immunhistochemistry and Western Blot. Bax /bcl2 served as the degree of apoptosis. RESULTS: The ratio of apoptosis was higher in group II than that in group I ［（147.6±32.6）‰ vs （4.1±1.8）‰, P<0.05］. The ratio of apoptosis was lower in group III than that in group II ［（46.2±12.3）‰ vs （147.6±32.6）‰, P<0.05］. The atrophy of skeletal muscle in group II was more serious that in group I（P<0.05）, but that in group III was less serious than that in group II. The expression of Bcl2 in group II was significantly lower than that in group I（P<0.05）, but the expression of Bax in group II was significantly higher than that in group I（P<0.05）. The expression of Bcl2 in group III was higher than that in group II（P<0.05）but the expression of Bax was lower that in group II（P<0.05）. The ratio of Bax/Bcl2 in group II was higher than that in group III. CONCLUSION: Cell apoptosis plays an important role in skeletal muscle atrophy in rats with myocardial hypertrophy and may be one of the factors causing skeletal muscle atrophy. Losarton can decrease skeletal muscle cell apoptosis and atrophy in myocardial hypertrophy rat through regulating the ratio of Bax / Bcl2.

【Keywords】 apoptosis; myocardial hypertrophy; skeletual muscle; losartan

【摘要】 目的：探讨细胞凋亡在心肌肥大大鼠骨骼肌萎缩中的作用及氯沙坦对心肌肥大大鼠骨骼肌萎缩的影响. 方法：雄性SD大鼠42只随机分成3组(n=14)：Ⅰ组（对照组），Ⅱ组（心肌肥大组），Ⅲ组（心肌肥大氯沙坦治疗组）. Ⅱ组和Ⅲ组分别一次性腹腔注射野百合碱（30 mg/kg）以诱导心肌肥大. 2 wk后，Ⅲ组大鼠用氯沙坦［10 mg/(kg・d)］灌胃. 再过2 wk后全部处死动物，以腓肠肌(GAS)的质量和体质量比作为骨骼肌萎缩的指标. TUNEL法检测GAS细胞凋亡. 免疫组化和Western Blot法检测GAS Bcl2，Bax的表达，并把Bax／Bcl2值作为凋亡的程度. 结果：与Ⅰ组比,Ⅱ组的GAS细胞凋亡率明显增加［（147.6±32.6）‰ vs （4.1±1.8）‰, P<0.05］，并且GAS出现了萎缩. 与Ⅱ组比，Ⅲ组的GAS细胞凋亡率明显减少［（46.2±12.3）‰ vs （147.6±32.6）‰, P<0.05］，GAS萎缩减轻. Bcl2的表达Ⅱ组比Ⅰ组明显减少（P<0.05），Bax的表达明显升高（P<0.05）. 而Ⅲ组与Ⅱ组相比Bcl2的表达明显升高（P<0.05）,Bax的表达明显减少（P<0.05）. Ⅱ组GAS的Bax／Bcl2值明显升高，而Ⅲ组Bax／Bcl2值明显下降. 结论：细胞凋亡在心肌肥大大鼠骨骼肌萎缩中发挥着重要的作用，可能是骨骼肌萎缩的原因之一，氯沙坦可能通过改变Bax／Bcl2值减轻心肌肥大大鼠骨骼肌的凋亡和萎缩.

【关键词】 细胞凋亡;心肌肥大;骨骼肌;氯沙坦

0引言

心肌肥大患者的疲劳和气短,部分是由于骨骼肌的萎缩引起的,是耐疲劳的骨骼肌Ⅰ型纤维转变成易疲劳的Ⅱ型纤维. 在心力衰竭患者的骨骼肌中,已证实萎缩既不是骨骼肌缺乏锻炼也不是由于骨骼肌血液动力学的改变［1］,也不联系骨骼肌蛋白的合成［2］. 我们的目的是通过复制心肌肥大大鼠的动物模型，来探讨细胞凋亡在心肌肥大大鼠骨骼肌萎缩中的作用和凋亡易感基因bcl2，bax的变化及氯沙坦能否减轻心肌肥大大鼠骨骼肌的萎缩.

1材料和方法

1.1材料

①动物模型及分组：健康雄性SD大鼠42只，体质量180～200 g(购于河南省动物实验中心)，随机分成3组（n=14）：Ⅰ组，正常对照组；Ⅱ组，心肌肥大组，腹腔一次性注射野百合碱30 mg/kg；Ⅲ组，氯沙坦治疗组，腹腔一次性注射野百合碱30 mg/kg，2 wk后用氯沙坦10 mg/(kg・d)灌胃(上午9:00空腹灌胃，1次/d), 2 wk，Ⅰ组和Ⅱ组分别以等剂量的生理盐水灌胃. ②试剂：TUNEL法检测凋亡试剂盒为华美生物工程公司产品，鼠抗鼠Bax和Bcl2 mAb为Santa Cruz公司产品，免疫组化试剂盒为北京中山生物技术有限公司产品.

1.2方法

①标本收集：在相同的条件下饲养4 wk后，用戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉动物，开胸取出心脏，称量右心室壁(RV)质量，左心室加室间隔(LV+S)质量,体质量（BM）,并计算RV／LV+S，RV／BM，作为判断右心室肥大的指标. 称量腓肠肌(gastrocnemius, GAS)的质量，并计算GAS／BM，作为判断骨骼肌萎缩的指标. GAS称量后，一部分经甲醛固定48 h后，石蜡包埋，切片备用做免疫组化，另一部分迅速放入液氮中保存备用做Western Blot. ②TUNEL法检测细胞凋亡：严格按照试剂盒的说明操作. 阴性对照以蒸馏水代替末端脱氧核糖核苷酸转移酶，阳性对照组先用DNA酶作用再行上述操作，镜下观察标记的阳性细胞. ③免疫组化检测Bcl2，Bax的表达：切片常规脱蜡水化,一抗为鼠Bax或Bcl2 mAb(1∶50稀释),严格按照免疫组化试剂盒的说明书操作,以PBS代替一抗作阴性对照,DAB显色,光镜观察阳性信号. ④Western Blot检测Bcl2, Bax蛋白的表达：按参考文献［3］提取蛋白,总蛋白上样量为100 μg，120 g/L聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳后蛋白条带转移至硝酸纤维素膜, TBST封闭后,特异性 mAb抗Bcl2(1∶500)或抗Bax(1∶500)与硝纤膜杂交4℃过夜, TBST洗膜, 37℃以辣根酶标记的二抗与硝纤膜杂交, DAB显色.

统计学处理：采用SPSS 10.0版软件包进行统计学处理. 数据采用x±s表示；Western Blot结果采用gelpro图像分析软件进行分析，得出灰度值. 对各组作单因素方差分析，方差齐时用LSD(最小显著差异法). 方差不齐时用Dunnets T3法作各组间的多重比较，P<0.05表示差异有统计学意义.

2结果

2.1成功制作了心肌肥大大鼠模型野百合碱腹腔注射4 wk后，大鼠出现了明显的食欲减退、活动量减少等症状. Ⅱ组较Ⅰ组的RV／LV+S明显增大（P<0.05），RV／BM明显增大（P<0.05），右心室出现了明显的肥大，说明心肌肥大的成功. Ⅲ组与Ⅱ组相比RV／BM降低（P<0.05）,而RV／LV+S无统计学差异(P>0.05),但也有下降趋势(表1).表1大鼠的心室重塑指标和骨骼肌萎缩的指标（略）

2.2GAS的变化Ⅰ组GAS富有弹性, Ⅱ组GAS明显萎缩,变小,失去弹性. GAS的湿质量显示，GAS／BM Ⅱ组与Ⅰ组比有统计学差异（P<0.05）,Ⅲ组与Ⅱ组相比虽无统计学差异(P>0.05)，但是有明显的减轻GAS萎缩的趋势(表1).

2.3TUNEL检测凋亡的细胞核呈棕色，细胞核常位于肌纤维的中央或离开周边的细胞膜. Ⅰ组鲜见凋亡的细胞核，而Ⅱ组发生凋亡的细胞核明显增多（P<0.05），Ⅲ组也可见到凋亡的细胞核，和Ⅱ组比较有统计学意义（P<0.05，表2）.表2大鼠腓肠肌的细胞凋亡、Bcl2，Bax表达的变化（略）

2.4Bcl2，Bax免疫组化Ⅱ组较Ⅰ组的Bcl2阳性率降低，提示Bcl2蛋白的表达明显下降（P<0.05），而Ⅲ组与Ⅱ组相比，Bcl2的阳性率升高，提示Bcl2蛋白的表达明显增加（P<0.05），Ⅲ组与Ⅰ相比Bcl2蛋白的表达无统计学差异(P>0.05). Bax的阳性率Ⅱ组较Ⅰ组增加，提示Bax蛋白的表达明显增加（P<0.05），而Ⅲ组与Ⅱ组相比Bax蛋白的表达明显下降（P<0.05），Ⅲ组与Ⅰ组相比无统计学差异(P>0.05). 代表凋亡程度的Bax/Bcl2的比率发生了较大的变化，Ⅱ组Bax/Bcl2>1，而Ⅲ组与Ⅱ组Bax/Bcl2<1(表2).

2.5Bcl2，Bax的Western BlotⅡ组较Ⅰ组Bcl2蛋白的表达明显下降（P<0.05），Bax蛋白的表达明显增加（P<0.05），而Ⅲ组与Ⅱ组相比Bcl2蛋白的表达明显增加（P<0.05），Bax蛋白的表达明显下降（P<0.05,图1,2），Ⅲ组与Ⅰ组相比无明显差异(P>0.05)(表2).

3讨论

Allen等［4］在研究制动造成骨骼肌萎缩的过程中发现，细胞凋亡参与了骨骼肌细胞萎缩的过程. 心力衰竭患者疲劳是因为骨骼肌出现了萎缩而并不是血液动力学的改变造成的，在正常人和心力衰竭患者之间下肢的血液动力学比较是没有意义的［1］. 我们的结果显示，腹腔注射野百合碱4 wk后大鼠形成了右心室的肥大, 在心肌肥大大鼠骨骼肌萎缩的过程中，通过TUNEL法检测到了细胞凋亡，而在氯沙坦治疗心肌肥大组，骨骼肌细胞凋亡明显减少（P<0.05）,说明氯沙坦有减轻骨骼肌细胞凋亡的作用.

Bcl2家族蛋白是在细胞凋亡过程中起重要作用的一类蛋白质, 根据它们在细胞凋亡中的作用可分为两类，如促凋亡的Bax, Bak等和抗凋亡的Bcl2, BclXL等. 许多研究结果均表明,线粒体在细胞凋亡过程中起着“主开关”作用,而Bcl2家族蛋白的主要作用位点就在线粒体膜上［5］. Bcl2和Bclxl通过其BH3结构域与Bcl2家族的促凋亡蛋白形成异二聚体, 阻止一些小分子如Ca2+从基质中释放以及凋亡诱导因子(AIF)从线粒体内外膜之间释放到胞质,从而维持促凋亡成员在细胞内的定位分布,保护细胞不进入凋亡程序［6］. Bcl2和Bclxl均能抑制细胞色素C的释放,使细胞色素C无法达到激活下游胱冬肽酶（caspase）的阈值,保护细胞不发生凋亡. 在有凋亡刺激因素的条件下，促凋亡和抗凋亡蛋白的比例是决定细胞命运的一个重要因素. 过度表达的Bcl2已经证明阻止细胞色素C的释放，从而阻止了凋亡的传导通路［7］. 相反，过度表达的Bax促进了细胞色素C的释放［8］. 本研究我们用免疫组化法和Western Blot法的检测结果，都表明在心肌肥大大鼠骨骼肌Bcl2的表达明显下降，而氯沙坦治疗后Bcl2表达明显升高（P<0.05）. 促凋亡蛋白Bax的表达在心肌肥大大鼠的骨骼肌是明显升高的，而氯沙坦治疗后明显降低（P<0.05）. 代表凋亡程度的Bax／Bcl2值发生了巨大的变化,在心肌肥大大鼠骨骼肌Bax／Bcl2的比值>1,在氯沙坦治疗后它的比值<1. 由于Bax／Bcl2的值发生了变化，从而激活了下游的caspase，导致caspase 的级联放大反应，促发了细胞凋亡的发生. 氯沙坦为选择性的血管紧张素Ⅱ1型受体阻滞剂，可以阻断血管紧张素Ⅱ与受体结合. 从本实验结果中可以看出它能够减轻右心室的肥大，也能够明显减少骨骼肌细胞的凋亡. 因此我们推测，氯沙坦能够减轻骨骼肌的萎缩.

本研究结果提示：细胞凋亡在心肌肥大骨骼肌萎缩中扮演着重要的作用，而氯沙坦能够减轻心肌肥大大鼠的骨骼肌的萎缩，其机制可能是通过血管紧张素Ⅱ1型受体，改变了凋亡蛋白Bax/Bcl2值，从而减轻了心肌肥大大鼠骨骼肌的细胞凋亡.

【参考文献】

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［3］ Fortuno MA, Ravassa S, Etayo JC, et al. Overexpression of Bax protein and enhanced apoptosis in the left ventricle of spontaneously hypertensive rats: Effects of AT1 blockade with losartan ［J］. Hypertension，1998, 32(2):280-286.

［4］ Allen DL, Linderman JK, Roy RR, et al. Apoptosis: A mechanism contributing to remodeling of muscle in response to bindlimb unweighting ［J］. Am J Physiol, 1997,273(2 Pt 1):C578-C587.

［5］ Green DR, Reed JC. Mitochondria and apoptosis ［J］. Science， 1998,281(5381): 1309-1312.

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［7］ 李俊峡，贾国良，金明,等. 转染bcl2基因对心肌细胞低氧/复氧损伤中细胞凋亡的影响［J］. 第四军医大学学报，2004，25（9）：780-782.

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