转化生长因子β1抗体对大鼠肾缺血—再灌注时SMAD7表达的影响

转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1， TGF-β1） 是一类多功能的细胞因子，由多种组织细胞合成，调控着细胞周期，影响细胞的增殖、分化、黏附、转移和凋亡，与人类多种疾病发生发展密切相关[1]。研究表明在大鼠肾缺血-再灌注时TGF-β1表达呈增加趋势[2]。与配体结合后，TGF-β家族受体激活了一个由Smad蛋白家族介导的独特的信号转导通路，Smad7是TGF-β/Smads蛋白信号通路中最重要的内源性抑制因子[3]。笔者采用注射TGF-β1抗体的方法来中和体内表达增多的TGF-β1，观察肾功能损害变化以及此通路上重要抑制因子Smad7的表达变化。

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康雄性SD大鼠80只，月龄6个月，体质量220～250 g，一级动物，由温州医学院实验动物中心提供。Smad7抗体、SABC免疫组化试剂盒由武汉博士德生物试剂公司提供，TGF-β1抗体由北京博奥申生物试剂公司提供，DAB显色液北京中杉金桥试剂公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及方法 雄性SD大鼠80只，随机（随机数字法）分为肾缺血-再灌注损伤模型组（A组）和TGF-β1抗体治疗组（B组），每组数量40只，组内按再灌注时间不同又分为再灌注0、4、12、24 h 4个小组，每组10只，分别在再灌注到0、4、12、24 h时取材。A组、B组均建立肾缺血-再灌注模型，再灌注达相应时间点时，从各小组大鼠腹主动脉取血2 ml备测血尿素氮（BUN）和血肌酐（Cr），然后迅速切除左肾，肾组织用10%甲醛固定，制备石蜡切片，作HE染色观察病理变化以及作免疫组化分析肾组织Smad7表达情况（方差分析）。采用全自动生化分析仪、免疫组化、HE染色，分别测定或观察血肌酐、尿素氮、肾组织Smad7表达、肾组织病理改变。

1.2.2 肾缺血-再灌注动物模型制作及标本采集 所有实验动物均术前12 h禁食，自由进水。实验大鼠应用10%的水合氯醛按300 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定，碘酒酒精消毒手术切口部位，在剑突到耻骨联合之间沿腹白线作一长约6 cm的纵切口开腹，找到双侧肾脏，小心分离右侧肾蒂，左侧肾蒂，用无损伤动脉夹夹闭左右侧肾蒂，阻断出入肾脏血流（在此过程中注意保持实验大鼠体温及减少腹腔的不显性失水），见肾颜色由红润变为暗红，表明肾血流阻断，45 min后重新恢复肾脏血液灌注，随后B组经腹腔静脉注射TGF-β1抗体（5 mg/kg），A组经腹腔静脉注射等量的生理盐水。当松开动脉夹后肾脏在2～5 min内颜色由暗红转为鲜红表明缺血-再灌注损伤模型建立成功，肾血管无血栓形成，关腹。若超过5 min肾脏颜色仍然未转为鲜红色则认为肾脏有血栓形成，排除出实验组。实验大鼠麻醉清醒后转入代谢笼内自由进水及进食。再灌注达相应时间点时，从各小组大鼠腹主动脉取血2 ml备测血尿素氮（BUN）和血肌酐（Cr），然后迅速切除左肾，置于冰盐水中，洗净表面血液，肾组织用 10%甲醛固定，制备石蜡切片。

1.3 指标检测

1.3.1 肾功能检测 所取血液标本1500 r/min离心30 min，用微量加样器吸取上清，置于EP管中，4 ℃保存于冰箱中。肌酐、尿素氮检测由温州医学院附属二院检验科协助完成。

1.3.2 病理学检验 制备肾组织石蜡切片，经HE染色后，光镜下观察肾组织病理改变。

1.3.3 免疫组织化学分析 石蜡切片经免疫组化处理后，采用Image Plus Pro 6.0软件分析免疫组化结果：视野里棕黄色颗粒视为阳性着色，根据着色深浅程度分级：无着色（阴性），浅黄色（弱阳性），棕黄色（阳性），深棕黄色（强阳性）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 12 for Windows软件包对实验数据进行统计学处理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采取方差分析的方法，组间两两比较采用LSD-t检验，以P

2 结果

2.1 肾功能变化

与同一时间点A组比较，0 h组A、B两组血浆BUN差异无统计学意义，其余B组各时间点血浆BUN均显著降低（P

与同一时间点A组比较，0 h A、B两组血浆Cr差异无统计学意义，其余B组各时间点血浆Cr均显著降低（P

2.2 肾组织形态改变

假手术组肾小球、肾小管结构完整。肾IR模型组肾脏病理变化明显，多数肾小管上皮细胞肿胀，出现水样变性，部分凝固性坏死、脱落，刷状缘消失，肾小管腔内可见管型，肾间质血管高度扩张充血，可见灶性出血区和灶性炎细胞浸润，但肾小球病变不明显。见图1。

2.3 各组肾组织中Smad7表达情况

在0 h时间点肾脏Smad7阳性表达两组表达差异无统计学意义（P>0.05）。B组肾脏Smad7阳性表达较A组在4、12、24 h均增多（均P

3 讨论

造成肾缺血的原因有很多，临床多见于休克肾、肾移植、肾部分切除及脓毒症等，如果患者能及时得到液体复苏治疗，又将不可避免的进入再灌注损伤过程。在缺血的基础上恢复血流后， 组织器官的损伤反而加重的现象称为缺血-再灌注损伤。肾缺血-再灌注损伤的发病机制复杂， 其损伤机制涉及氧化应激、能量代谢障碍、细胞膜通透性增高缺血缺氧引起的细胞酸中毒、线粒体受损、无复流现象、细胞凋亡及其相关信号转导通路，并与之密切相关[4]。TGF-β1由多种组织细胞合成，调控着细胞周期，影响细胞的增殖、分化、黏附、转移和凋亡。赵广阔等[2]研究表明在大鼠肾缺血-再灌注时TGF-β1表达增加。姚晓雷等[5]将TGF-β1抗体应用于肺损伤研究中，不仅可以减少肺损伤急性期细胞的凋亡，而且可以阻止晚期肺纤维化的发生发展。为了研究TGF-β1抗体对肾缺血-再灌注损伤的影响及重要抑制性因子Smad7的表达，笔者设计了本实验。

实验发现，与配体结合后，TGF-β家族受体激活了一个由Smad蛋白家族介导的独特的信号转导通路。激活的受体分次序磷酸化R-Smads（通路限制Smad，如Smad1、2、3、5、8等），从而激活了R-Smads。已磷酸化的R-Smads与Co-Smads（共配偶体Smad，Smad4）联合形成异源多聚体（每种Smad至少有一个分子参与）。然后该复合物易位至细胞核内，调控靶基因的转录，从而调控着细胞周期，影响细胞的增殖、分化、黏附、转移和凋亡。Smad6和Smad7属I-Smads，与TR结合，属Smad活化过程中的竞争抑制者[6-7]。研究表明Smad7的负调控作用存在缺点，有研究观察到缺乏配体时，Smad7主要位于细胞核内，有配体存在时，Smad7需完成核到胞质转移过程，才能与受体结合。该负调控机制存在反应缓慢，而且也存在蛋白合成不足的问题[8]。

据报道，采用药物作用下调TGF-β1表达可以有效的缓解肾功能的恶化[9]，同时发现Smad7的表达减少可以增加肾小管上皮细胞凋亡的发生[10]。本次实验结果提示，在应用TGF-β1抗体干预后大鼠肾功能较模型组有所改善，肾组织形态学提示肾脏损伤有所减轻， Smad7表达较模型组也有所增多，表明在应用TGF-β1抗体干预后大鼠肾缺血-再灌注急性损伤明显减轻，其机制可能涉及到一方面抗体中和后减轻了TGF-β1的生物学效应，另一方面Smad7表达增多一定程度上也抑制了TGF-β/Smads蛋白通路信号转导、功能执行。如何预防肾缺血-再灌注损伤，做到早期预测，目前研究的生物标记物有半胱氨酸蛋白酶抑制剂、尿肌动蛋白等[11]，TGF-β1及Smad7因子监测是否也可以用来早期预测肾功能改变有待研究。在肾缺血-再灌注损伤时，是通过何种生物学机制下调Smad7表达， Smad7表达减少是否和TGF-β1过表达有直接关系，TGF-β1及Smad7因子监测是否比其他生物标记物更早预警肾功能恶化，这些问题需要进一步研究明确。

参考文献

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（收稿日期：2012-07-02）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2012.11.013

作者单位：325027 浙江省温州，温州医学院附属第二医院急诊科

通信作者： 陈大庆，Email：

中华急诊医学杂志2012年11月第21卷第11期Chin J Emerg Med，November 2012，Vol.21，No.11

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