槲皮素对TGF—β诱导的人肺癌A549细胞上皮间质转化的影响

[摘要] 目的 探讨槲皮素对TGF-β诱导的人肺癌A549细胞上皮间质转化的影响。 方法 在体外分别采取槲皮素及阴性对照DMSO干预经或不经TGF-β（10 ng/mL）诱导的人肺癌A549细胞12、24、48、72 h后，MTT法检测不同浓度槲皮素对A549细胞增殖的影响；RT-PCR和Westem blot实验检测上皮间质转化标志性因子E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达变化。 结果 与阴性对照组相比，不同浓度槲皮素作用的实验组A549细胞的增殖能力降低，同时在mRNA和蛋白水平E-cadherin上调以及N-cadherin、Vimentin的表达下调（P < 0.05）。 结论 槲皮素能够抑制TGF-β 诱导的人肺癌A549细胞的增殖，且呈时间-剂量依赖性，阻止A549细胞发生上皮间质转化，降低A549细胞的迁移侵袭运动能力。

[关键词] 槲皮素；转化生长因子β（TGF-β）；A549细胞；上皮间质转化（EMT）

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）05-0006-03

肺腺癌是肺癌最常见的组织学类型，约占所有肺癌的50%，且70%～90%手术切除的肺腺癌为浸润性腺癌[1]。肺腺癌的浸润转移是一个非常复杂的过程，涉及多种因素和多种机制。目前，上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在肺腺癌浸润转移中的作用引起研究者的关注。EMT是肿瘤浸润、转移的一个非常重要的机制，与肿瘤后期的转移和纤维化关系密切，研究EMT及其相关信号传导通路可为控制肺癌的发生发展提供有效策略[2]。在EMT发生过程中，肿瘤组织中的上皮细胞标志物E-cadherin下调，间质细胞标记物N-cadherin和Vimentin上调。EMT的发生是一个复杂的过程，多种细胞因子和信号通路参与其调控[3]。其中，转化生长因子β（TGF-β）是一个比较明确的可诱导上皮发生EMT 的重要诱导因子[4，5]。

槲皮素（Quercetin，Que）是黄酮类化合物重要的一员，属于黄酮醇类化合物，在植物中多以糖苷的形式存在。槲皮素及其衍生物具有抗心律失常、抗血小板聚集、扩张血管、抗氧化、抗肿瘤等作用，因此槲皮素及其衍生物的合成和药理活性研究受到越来越多人的关注，但其作用机制目前仍不清楚。本研究旨在通过观察槲皮素对TGF-β诱导A549上皮细胞间质转化（EMT）的影响，为开发新的抗肺癌药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人肺腺癌细胞株 A549购自中科院上海细胞库。

1.1.2 主要试剂及设备 H-DMEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司；兔抗人E-cadherin单抗、兔抗人N-cadherin单抗、兔抗人Vimentin单抗购自Epitomics公司；兔抗人β-actin单抗购自北京中衫金桥公司；槲皮素（Quercetin）、TGF-β、四甲基偶氮唑盐（MTT）和二甲亚枫（DMSO）均购自美国 Sigma 公司；Trizol、RT-PCR逆转录试剂盒、Premix Taq酶、DNA marker均购自TaKaRa公司；凯基全蛋白提取试剂盒购自凯基生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、PVDF膜、琼脂糖（Agarose）、TAE（50×）均购自Beyotime（碧云天）公司；ECL发光试剂盒购自Millipore公司；磷酸盐缓冲液（PBS）、构橼酸钠抗原修复液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 实验方法和步骤

1.2.1 细胞培养 A549细胞用含10%胎牛血清（FBS）H-DMEM细胞培养基，在5%的CO2饱和湿度、37℃恒温培养箱中常规培养。A549细胞呈单层贴壁生长，每2～3天换1次液，3～4 d传代1次。A549细胞经过消化传代，取对数生长期细胞待用。

1.2.2 药物处理与分组 槲皮素用DMSO配成储液后于-20℃冰箱保存。实验时用H-DMEM培养基稀释，DMSO的终浓度小于0.1%。实验分3组，分别为TGF-β未干预组（A组）、溶剂对照组（B组）和实验组（C组）。A组为H-DMEM+DMSO培养液，不含TGF-β，DMSO为等浓度溶剂；B组为H-DMEM培养+10 ng/mLTGF-β+DMSO，即槲皮素浓度为0；C组为H-DMEM培养液+10 ng/mL TGF-β+不同梯度浓度的槲皮素，槲皮素的终浓度分别为5、12.5、25、50、100、200 μmol/L。

1.2.3 MTT法检测 取对数生长期的A549细胞悬液，以每孔3×103个细胞接种于96孔培养板，每孔加含10%FBS及TGF-β（10 ng/mL）H-DMEM培养液200 μL，于37℃、5% CO2培养箱培养8 h，在倒置显微镜下观察细胞贴壁后，按上述分组分别加入200 μL完全培养液（TGF-β未干预组）、含DMSO的培养液（溶剂对照组）以及含不同药物浓度的培养液（实验组）。继续培养12、24、48、72 h，每浓度设5个复孔，于各时间段前4 h每孔避光加入MTT（5 g/L，PBS）20 μL，培养终止后弃上清加入DMSO 150 μL/孔，振荡溶解10 min，待结晶完全溶解后于酶标仪570 nm处检测各个浓度的吸光度值（A值），计算细胞的抑制率。细胞增殖抑制率（IR）=[（1-药物处理组平均吸光度-溶剂对照组平均吸光度）/（对照组平均吸光度-溶剂对照组平均吸光度）]×100%。

1.2.4 RT-PCR检测 采用Trizol一步法提取细胞药物干预48 h后的总RNA，鉴定完RNA纯度和完整性后，反转录制备cDNA，以cDNA为模板，在反应体系中加入目的基因和内参对照基因的引物（表1），设定反应参数，进行目的基因的扩增。PCR产物用2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统分析拍照并对凝胶条带的信号强度进行半定量分析，以E-cadherin/β-actin、N-cadherin/β-actin、Vimentin/β-actin比值分别代表各自相对表达水平。2-ΔΔCT法计算E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA的相对表达量。每个实验组重复3次。

1.2.5 Western blot检测 分组收集用药物干预A549细胞48 h后的细胞，加入适量细胞裂解液，冰浴30 min，高速离心后取上清采用BCA法测定蛋白浓度，调整到标准浓度后分别取50 μL样品进行SDS-PAGE电泳，半干转膜法转至 PVDF膜。5%的脱脂奶粉封闭1 h，分别加一抗稀释液（兔抗人单克隆抗体）4℃孵育过夜，再用辣根酶标记山羊抗兔IgG二抗37℃孵育1 h。PBST 缓冲液洗膜10 min×3次。ECL荧光显色后在暗室中进行X片曝光，结果用凝胶成像系统分析拍照并对凝胶条带的信号强度进行半定量分析，以E-eadherin/β-actin、N-cadherin/β-actin、Vimentin/β-actin的比值作为各自蛋白的相对表达强度。

1.3 统计学处理

采用 SPSS13.0 统计软件进行统计分析，计量数据以均数±标准差（x±s）表示，多组数据间比较采用方差分析，组间两两比较采用q检验，各变量间关系采用直线相关分析。比较用t检验。P < 0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测槲皮素对TGF-β诱导下A549细胞增殖抑制的影响

MTT 结果显示，不同浓度的槲皮素（Que）能抑制A549细胞增殖能力的上调。在12、24、48、72 h各组OD值见图1。不同浓度的槲皮素对TGF-β诱导下A549细胞的生长均有抑制作用，随着浓度的增加，抑制率呈明显上升趋势，显示抑制作用呈剂量依赖关系，当槲皮素浓度大于50 μmol/L时，其对TGF-β诱导下A549细胞的增殖抑制明显增强，但当浓度达200 μmol/L时，其增殖抑制率增强不明显；槲皮素在对TGF-β诱导作用不同时间下 A549 细胞的生长抑制作用亦有不同，当槲皮素对A549 细胞作用48 h 和72 h 后，抑制率没有明显变化，但都高于24 h，可见，槲皮素作用A549 细胞 48 h 后，药效基本达到最大，即存在时间依赖。

2.2 槲皮素对TGF-β诱导下A549细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA表达的影响

槲皮素（Que）作用48 h，RT- PCR检测其TGF-β诱导下A549细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA的相对表达变化（图2）。与对照组相比较，实验组的E-cadherin mRNA相对表达水平随槲皮素作用浓度的增加而升高，而N-cadherinm RNA和Vimentin mRNA的表达随槲皮素作用浓度的增加而降低；当槲皮素浓度大于25 μmol/L时，与对照组相比，三者表达变化均具有明显差异（P < 0.05）。

2.3 槲皮素对TGF-β诱导下A549细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白表达的影响

将槲皮素（50 μmol/L）处理TGF-β诱导下A549细胞48 h后，Western blot测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白表达变化。与对照组相比，E-cadherin蛋白表达下调，N-cadherin、Vimentin 蛋白表达上调，二者灰度值比较均具有统计学意义（P < 0.05）。见图2。

3 讨论

肺腺癌已严重威胁着人类的健康，由于其侵袭力强，往往发现病情即已转移，手术、放化疗是其治疗的重要手段[6]，但其治疗效果不理想，寻求一种低毒、高效的天然植物成分已成为抗肿瘤的希望。槲皮素作为一种具有潜在研究价值的中药成分，由于其作用靶点多、自身不良反应少，在杀伤肿瘤细胞的同时有调节和提高机体免疫功能的多重功效。因此，其作为肿瘤治疗药物较其他化疗药物有很大优越性。

本实验结果表明，不同浓度的槲皮素对人肺腺癌A549细胞的生长和增殖有明显的抑制作用，并呈剂量-效应关系，且对EMT 标志性分子的影响具有显著性差异（P < 0.05）。说明一定浓度的槲皮素可抑制TGF-β 诱导的人肺癌A549细胞的生长，阻止A549细胞发生上皮间质转化，从而降低A549细胞的迁移侵袭运动能力。

肿瘤细胞的侵袭和转移是恶性肿瘤的基本特征之一，上皮间质转化在肿瘤细胞的侵袭转移过程中的作用已成为近年来肿瘤研究的热点。肿瘤细胞可通过EMT这个过程发生去分化获得较强的侵袭转移能力，从而导致纤维化紊乱，引起肿瘤发生[7，8]。在体外，肿瘤上皮细胞被TGF-β1诱导刺激经表型转换成为纤维细胞，从而促使EMT发生，EMT同时赋予肿瘤细胞以侵袭迁徙和干细胞的特性，肿瘤侵润免疫细胞（tumor-infiltrating immune cells）产生和分泌细胞因子TGF-β，可能通过参与 Wnt、Ras等干细胞传导通路诱导EMT发生[9]。Mitsuo Sato等[10]近期阐述了肺癌发生EMT可能是一些原癌（如K-RAS）突变和肿瘤微环境（炎症和缺氧）共同作用的结果，与非小细胞肺癌EMT相关的分子包括Epithelial cadherin、Vimentin、TGF-β、SLUG、SNAIL、TWIST、HIF-1α、miR-200c等。

中医药预防肿瘤的侵袭和转移的研究正日益受到重视。槲皮素抗肿瘤作用机制正逐渐深入，但针对槲皮素对肿瘤EMT的作用研究少见报道[11]。我们的研究发现槲皮素能明显抑制TGF-β诱导下人肺腺癌细胞A549的生长增殖能力，且可阻止其发生EMT推测槲皮素在肿瘤上皮细胞发生EMT的关键阶段起重要作用，可能与肿瘤细胞的重编程有关，作用机制有待于进一步研究。

[参考文献]

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[8] Guarino M，Tosoni A，Nebuloni M，et al. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis：epithelial-mesenchymal transition[J]. Hum Pathol，2009，40（10）：1365-1376.

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[10] Mitsuo Sato，David S，Shames，et al. Emerging evidence of epithelial-to-mesenchymal transition in lung carcinogenesis[J]. Respirology，2012，17（7）：1048-1059.

[11] Lin YS，Tsai PH，Kandaswami CC，et al. Effects of dietary flavonoids，luteolin，and quercetin on the reversal of epithelial-mesenchymal transition in A431 epidermal cancer cells[J]. Cancer Sci，2011，102（10）：1829-1839.

（收稿日期：2012-12-13）