槲皮素对转化生长因子诱导人脐静脉内皮细胞内皮―间质转化的影响

摘要：目的 观察槲皮素对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）-12内皮-间质转化的影响，探讨其作用机制。方法 CCK-8法检测不同浓度槲皮素和/或TGF-β1干预HUVEC-12 72 h后细 摘要：目的 观察槲皮素对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）-12内皮-间质转化的影响，探讨其作用机制。方法 CCK-8法检测不同浓度槲皮素和/或TGF-β1干预HUVEC-12 72 h后细胞活力；RT-PCR和免疫荧光双染检测内皮及间质标记物的转变；Western blot检测信号通路；RT-PCR检测在转变过程中发挥关键调节作用的转录因子。结果 RT-PCR和免疫荧光双染结果均提示，TGF-β1（10 ng/mL）连续刺激HUVEC-12 72 h可诱导其转化为成纤维细胞表型，表现出更多的间质标记物升高，内皮标记物降低；Western blot和RT-PCR结果显示，槲皮素呈浓度依赖性抑制smad2/3的磷酸化；TGF-β1刺激后，下游调控内皮-间质转化的重要转录因子snail1、twist1、twist2、ZEB1、ZEB2均明显升高，而100 μmol/L槲皮素则可显著下调下游的5种转录因子。结论 槲皮素可抑制TGF-β1诱导的HUVEC-12发生内皮-间质转化而发挥抗纤维化的作用。

P键词：槲皮素；内皮-间质转化；脐静脉内皮细胞；纤维化

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.017

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）02-0065-05

胞活力；RT-PCR和免疫荧光双染检测内皮及间质标记物的转变；Western blot检测信号通路；RT-PCR检测在转变过程中发挥关键调节作用的转录因子。结果 RT-PCR和免疫荧光双染结果均提示，TGF-β1（10 ng/mL）连续刺激HUVEC-12 72 h可诱导其转化为成纤维细胞表型，表现出更多的间质标记物升高，内皮标记物降低；Western blot和RT-PCR结果显示，槲皮素呈浓度依赖性抑制smad2/3的磷酸化；TGF-β1刺激后，下游调控内皮-间质转化的重要转录因子snail1、twist1、twist2、ZEB1、ZEB2均明显升高，而100 μmol/L槲皮素则可显著下调下游的5种转录因子。结论 槲皮素可抑制TGF-β1诱导的HUVEC-12发生内皮-间质转化而发挥抗纤维化的作用。

关键词：槲皮素；内皮-间质转化；脐静脉内皮细胞；纤维化

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.017

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）02-0065-05

心室重构过程中会发生心肌间质纤维化，而间质纤维化的主要特点为细胞外基质过度沉积和间质细胞如肌成纤维细胞的增殖，进而导致心肌组织毛细血管密度降低，心室顺应性也降低，最终心肌顺应性下降，导致心力衰竭。研究显示，抗纤维化治疗可明显改善心力衰竭患者预后，在心肌纤维化进程中，除固有的成纤维细胞会发生活化增殖外，内皮细胞、上皮细胞、单核细胞、循环纤维细胞等均可通过一定机制转化为成纤维细胞，抑制内皮-间质转化可显著改善心室重构及心功能[1-2]。

槲皮素及其衍生物分布广泛，现代药理研究表明，其具有抗肿瘤、抗氧化、抗血小板聚集、保护心血管功能以及抗病毒的作用[3]，具有抑制成纤维细胞增殖、抑制胶原合成、阻止氧化损伤、抑制血管生成等抗纤维化作用[4-5]。本实验观察槲皮素对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）-12内皮-间质转化的影响，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 药物

槲皮素，购自上海融禾医药科技发展有限公司，纯度≥99%，货号117-39-5。

1.2 细胞

HUVEC-12，YRGene（NC006）。37 ℃、5.0%CO2培养箱培养，当细胞密度铺满80%培养皿底时，采用0.25%胰酶消化后进行传代。对细胞采取刺激前，将培养细胞所用的培养基换为无血清培养基。

1.3 主要试剂与仪器

DMEM basic（1×）培养基、新生小牛血清（NBS）、胰酶，Gibco； CCK-8检测试剂盒，日本同仁化学研究所；RT-PCR试剂盒，Roche；TGF-β1，PEPROTECH公司；ECGS，ScienCell公司；CD31、vimentin抗体，ABCAM公司；p-smad2、p-smad3、GAPDH，Cell Signaling Technology公司；smad2、smad3，Santa Curz公司；引物由上海生工合成。多功能微孔板检测系统Synergy HT（美国BioTek），恒温培养箱（日本SANYO），紫外分光光度计NANODROP 2000c（Thermo scientific），RT反转录仪Veriti 96 well Thermal Lycler（Applied Biosystems），实时定量PCR仪Light Lycler 480（美国Roche），倒置相差显微镜DP72（日本OLYMPUS）。

2 实验方法

2.1 细胞处理及分组

待HUVEC细胞生长密度达60%时，弃去培养基，PBS清洗3次，加入无血清培养基，4 h后置换为含TGF-β1（10 ng/mL）无血清培养基，置于温箱培养，12 h换液1次，72 h后收取蛋白质和RNA样本。实验分为对照组、TGF-β1组、TGF-β1+槲皮素10 μmol/L组、TGF-β1+槲皮素50 μmol/L组、TGF-β1+槲皮素100 μmol/L组、槲皮素100 μmol/L组。

2.2 细胞毒性试验

细胞被接种至96孔板中，每孔100 μL，密度为2×105个/mL，置于温箱培养24 h，将培养基更换为无血清培养基饥饿6 h，干预72 h，将96孔板中培养基换为含有10 μL CCK-8无血清培养基100 μL，继续孵育2～2.5 h，于酶标仪波长450 nm处测定光密度（OD）值。

2.3 RT-PCR检测

细胞以不同因素处理后，弃去培养基，Trizol法提取细胞总RNA，紫外分光光度法测定其含量与纯度。取大约5 μL总RNA反转录为cDNA。以GAPDH为内参，应用20 μL体系进行PCR扩增。反应条件：94 ℃、2 min，1个循环；94 ℃、40 s，25～35个循环；50～65 ℃、40 s，72 ℃、1 min，72℃、5 min，1个循环。

2.4 Western blot检测

细胞裂解液冰上裂解细胞10 min，手机并提取蛋白。校正GAPDH后，每组以校正后体积进行10%SDS-PAGE凝胶电泳，后将蛋白以100 V、90 min转移至PVDF膜上，用一抗封闭液（1∶1000）进行封闭，然后用TBST洗膜，一抗孵育过夜后加入相对应的二抗（1∶5000）行显色反应。应用Odyssey图像分析软件检测各组蛋白的相对密度值作为蛋白表达水平，均以GAPDH作为内参。

2.5 免疫荧光双染检测

干预结束后，去培养基，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次，再以0.2%Triton通透细胞5 min，PBS漂洗3次，细胞爬片滴加25 μL 8%新生胎牛血清，置于湿盒内，置于37 ℃温箱中孵育1 h，滤纸将封闭液吸干，滴加含有CD31/vimentin的一抗稀液（1∶200），置于4 ℃冰箱过夜，将湿盒取出置于37 ℃温箱复温1 h，将细胞爬片从24孔中取出，置于防脱切片上，滴加含有2种不同颜色的二抗（1∶2000），室温下避光孵育1 h，PBS漂洗3次，DAPI封片置于正置荧光显微镜下观察并拍照。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以―x±s表示，多组间均数比较采用方差分析，组间两两均数比较采用S-N-K法（方差齐）或Dunnett's T3（方差不齐）检验。P

4 结果

4.1 槲皮素对人脐静脉内皮细胞-12细胞活力的影响

干预72 h后，10、50、100 μmol/L槲皮素及其与TGF-β1的混合液对HUVEC-12细胞活力与未加任何处理因素的对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结果见表1。

4.2 槲皮素对转化生长因子-β1诱导的人脐静脉内皮细胞-12发生内皮-间质转化的影响

槲皮素（10、50、100 μmol/L）与TGF-β1协同刺激HUVEC-12 72 h呈浓度依赖性抑制Ⅰ型胶原蛋白（Collagen Ⅰ）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白（vimentin）、纤维连接蛋白（fibronectin）的表达，同时呈浓度依赖性促进CD31的表达，见表2。光镜结果显示，对照组光镜下表现为铺路石样，连接比较紧密，TGF-β1刺激72 h后细胞形态转化为狭长形，连接较松散，TGF-β1与槲皮素（100 μmol/L）共同刺激72 h，细胞形态又重新变为铺路石样，连接较紧密，单用100 μmol/L槲皮素刺激72 h细胞形态与对照组相似，见图1。

5 讨论

内皮细胞通过内皮-间质转化机制转化的成纤维细胞在心肌纤维化中发挥着重要作用。本研究发现，TGF-β1连续刺激HUVEC-12 72 h可诱导其转化为成纤维细胞表型，表现出更多的间质标记物升高，而内皮标记物降低。Western blot结果显示，槲皮素可能通过抑制TGF-β1/Smads信号通路以及其下游的转录因子发挥抑制内皮-间质转化作用。以上结果均提示，槲皮素可抑制TGF-β1诱导的HUVEC-12发生内皮-间质转化而发挥抗纤维化的作用。

上皮-间质转化是上皮细胞失去上皮特性获得间质细胞表型的一种生物现象，发生上皮-间质转化后细胞E-钙黏蛋白、角蛋白等上皮标记基因表达降低，vimentin、fibronectin、N-钙黏蛋白等间质标记基因表达升高。研究表明，上皮-间质转化参与肿瘤侵袭转移，在肿瘤转移过程中，癌细胞通过上皮-间质转化而获得间质细胞表型和侵袭性，实现对周围组织的浸润，在种植部位，癌细胞通过间质-上皮细胞转化最终形成与原发灶形态结构相似的转移灶，内皮-间质转化是上皮-间质转化的一种形式，近年来，随着对器官纤维化发生发展机制的研究逐步深入，内皮-间质转化逐渐受到研究者的关注[6]。在器官纤维化进展到一定阶段时，小血管内皮细胞会逐渐转变为合成和分泌功能活跃的成纤维细胞，再进一步转化为肌成纤维细胞，完成内皮-间质转化的转变。Zeisberg E M等[2]于2007年首次发现在压力负荷诱导的小鼠心肌纤维化中，内皮细胞通过内皮-间质转化现象转变为成纤维细胞，对心肌纤维化起到一定的促进作用，抑制内皮-间质转化则可显著改善心肌功能，表明内皮-间质转化对心肌纤维化具有重要作用。

本研究以TGF-β1诱导的HUVEC-12建立内皮-间质转化模型，明确间质微环境在内皮细胞内皮-间质转化中的作用，明确内皮-间质转化过程与信号通路之间关系，采用10 ng/mL TGF-β1连续刺激HUVEC-12 72 h，细胞形态由铺路石样转化为狭长形的成纤维细胞性状，细胞之间的连接也从紧密连接转换为松散连接，细胞间缝隙增大，RT-PCR检测结果显示，间质标记物Collagen Ⅰ、α-SMA、vimentin、fibronectin均表达上调，而内皮细胞标记物CD31则表达下调，由此可以判断TGF-β1可诱导HUVEC-12发生内皮-间质转化，而TGF-β1与槲皮素同时干预HUVEC-12 72 h则可呈浓度依赖性逆转内皮-间质转化现象，上调内皮细胞标记物，下调间质标记物，免疫荧光双染结果也得到同样结果。内皮-间质转化是内皮细胞来源的内皮细胞获得具有迁移和侵袭能力间质细胞的重要生物学过程。因而，阐明调控内皮细胞发生内皮-间质转化过程的分子机制，明确其在心肌纤维化发生、发展过程中的病理意义，并探索基于内皮-间质转化关键分子的诊断方法及靶向内皮-间质转化关键分子的治疗手段是心肌纤维化中内皮-间质转化机制研究的关键问题。

TGF-β1/Smads信号通路及其下游的一些转录因子在心脏内皮-间质转化中发挥着重要的调控作用，这些包括snail和twist锌指转录因子家族成员以及ZEB家族[7-9]。本研究检测了TGF-β1/smads信号通路及其下游的靶分子的表达，包括snail1、twist1、twist2、

其下游的靶分子snail1、twist1、twist2、ZEB1、ZEB2均表达上调，而TGF-β1与槲皮素（100 μmol/L）联合作用时，则可显著降低smad信号通路的磷酸化水平以及抑制其下游的靶分子。因此，我们认为槲皮素可能通过抑制TGF-β1/smads信号通路以及其下游的靶分子表达抑制HUVEC-12发生内皮-间质转化现象。

槲皮素作用机制复杂，几乎涉及组织器官纤维化的各个环节：①抑制成纤维细胞增殖；②抑制胶原合成；③抗氧化损伤；④抑制内皮细胞生长，抑制血管形成；⑤影响细胞周期，诱导细胞凋亡。本研究结果表明，槲皮素可抑制TGF-β1诱导的HUVEC-12发生内皮-间质转化环节，为进一步探讨槲皮素的临床治疗提供了实验依据。此外，本研究也探讨了槲皮素对内皮-间质转化的作用并鉴定其可能作用的信号通路及转录因子，但未能阐明其具体的作用机制，也未能在大体动物模型中进一步验证，有待进一步完善相关实验，明确其作用机制。

参考文献：

[1] VASAN R S， BENJAMIN E J. Diastolic heart failure―no time to relax[J]. N Engl J Med，2001，344（1）：56-59.

[2] ZEISBERG E M， TARNAVSKI O， ZEISBERG M， et al. Endothelial to mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis[J]. Nat Med，2007，13（8）：952-961.

[3] _莉莎，刘苏.槲皮素抗纤维化作用机制研究进展[J].国外医学：中医中药分册，2005，27（6）：330-332.

[4] 徐向进，张荔群，王庆彪，等.槲皮素对糖尿病大鼠肾脏的保护作用[J].中华内分泌代谢杂志，2001，2（5）：316-319.

[5] PHAN T T， LIM I J， CHAN S Y， et al. Suppression of transforming growth factor beta/smad signaling in keloid-derived fibroblasts by quercetin：implications for the treatment of excessive scars[J]. J Trauma，2004，57（5）：1032-1037.

[6] KALLURI R， NEILSON E G. Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis[J]. J Clin Invest，2003，112（12）：1776-1784.

[7] FENG X H， DERYNCK R. Specificity and versatility in TGF-beta signaling through Smads[J]. Annu Rev Cell Dev Biol，2005，21（13）：659-693.

[8] VALCOURT U， KOWANETZ M， NIIMI H， et al. TGF-beta and the Smad signaling pathway support transcriptomic reprogramming during epithelial-mesenchymal cell transition[J]. Mol Biol Cell，2005， 16（4）：1987-2002.

[9] SATO M， MURAGAKI Y， SAIKA S， et al. Targeted disruption of TGF-beta1/Smad3 signaling protects against renal tubulointerstitial fibrosis induced by unilateral ureteral obstruction[J]. J Clin Invest，2003，112（10）：1486-1494.

（收稿日期：2016-03-01）

（修回日期：2016-03-26；编辑：华强）