倍性薯蓣的核型染色体分析

本文作者：黄贤兰、 郭华春 单位：云南农业大学薯类作物研究所

盾叶薯蓣(DioscoreazingiberensisC.H.Wright)，俗称黄姜、火头根，为薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属根状茎组(sect.stenophoraUline)，是我国特有的、狭域分布的薯蓣物种之一，主要分布在河南南部、湖南、湖北、陕西秦岭以南、四川等地,垂直分布在海拔100~1500m的河谷、山地，落叶阔叶与常绿落叶阔叶混交林的边缘或稀疏的常绿灌木林内［1］。盾叶薯蓣根茎含1.1%~16.5%的薯蓣皂甙元(皂素)，居世界薯蓣属植物之冠，为我国特有的甾体激素类药源植物［2］。薯蓣皂苷元是制造避孕药等甾体激素类药物的重要原料，其结构经改造和合成后，可得到数千种甾体激素类药物，素有“医药黄金”和“激素之母”之称，国内外市场需求量很大［3］。但由于过去对盾叶薯蓣大量无节制地采挖，致使野生资源遭到严重破坏，濒临枯竭，且人工栽培的盾叶薯蓣也面临着种质退化现象。之前，曾对盾叶薯蓣的染色体进行过大量研究，丁志遵等［4－5］报道了根状茎组(包括盾叶薯蓣)染色体数目为2n=20，并认为该属染色体基数x=10。但黄涛等［6］对盾叶薯蓣野生植株的研究表明，一些居群的染色体数目为2n=30、40，同时个体内还存在着混倍体现象。郑晓琴等［7］在对盾叶薯蓣进行选育的过程中，观察到自然变异类型三倍体和四倍体植株。但有关盾叶薯蓣染色体核型等的进一步分析研究却鲜见报道。染色体是遗传物质的载体，对作物的染色体进行数目、形态和结构分析是作物育种的基础。本研究对云南农业大学薯类作物研究所采集并保存的盾叶薯蓣野生种源和栽培株系的染色体数目进行鉴定及核型分析，旨在为盾叶薯蓣提供详细的细胞学资料，同时为盾叶薯蓣的自然变异类型的利用和遗传改良奠定基础。

1材料和方法

1．1实验材料对采自云南永胜、邱北、怒江、华坪以及陕西安康等地的盾叶薯蓣(DioscoreazingiberensisC.H.Wright)，引种栽培于云南农业大学农学院实习基地，筛选比较好的株系进一步繁殖栽培，本实验取其中4份(表1)栽培株系及1份野生材料进行盆栽种植，培养根尖用于核型分析。

1．2方法染色体标本制备采用酶解去壁低渗法制备根尖体细胞染色体。于生长旺盛季节取生长状态良好的盾叶薯蓣根尖用0.04%8-羟基喹啉于4℃冰箱内预处理3h，用现配的卡诺Ⅰ固定液(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1)在4℃冰箱内暗中固定24h后，于室温下用蒸馏水低渗30min以上，用0.25mol/LHCl酸解10min，蒸馏水清洗后浸泡10min;再用酶解缓冲液浸泡10min;加入酶解液(5%的纤维素酶和1%的果胶酶混合液)于离心管中在37℃培养箱中酶解1~2h(具体时间视材料的体积大小而定)。然后用较粗的吸管去除酶液，再加少量的蒸馏水，在室温下低渗30min以上;用较粗的吸管将根尖吸出滴在玻片上，吸去周围的水，用改良苯酚品红染色，盖上盖玻片压片。核型分析用德国ZeissAxioskop2plus显微镜观察，选分裂好的中期分裂相拍照(目镜10×，物镜100×)。依据李懋学等［8］的标准，每份材料选取约20个细胞作染色体计数，其中85%以上的细胞具有恒定一致的染色体数即可认为是该植物的染色体数目。选取5个染色体分散较好的中期细胞，参照李懋学等［8］的方法核型分析，核型分类按Stebbins［9］的标准划分，在IkarosKaryotypingSystem软件上分析。相对长度指数(Indexofrelativelength，I.R.L)按Kuo［10］的方法计算,I.R.L=染色体长度/全组染色体平均长度，即I.R.L＜0.76为短染色体(S);0.76≤I.R.L≤1.00为中短染色体(M1);1.01≤I.R.L≤1.25为中长染色体(M2);I.R.L≥1.26为长染色体。核型不对称系数(asymmetricalkaryotypecoefficient，As.K.C)按Arano［11］的方法计算，As.K.C=长臂总长/全组染色体总长，比值越大，越不对称。

2结果和分析

盾叶薯蓣野生种和4个栽培品种(A02-6、A05-6、A09-2-1和‘红卫’)的染色体参数和核型分析见表2和表3;中期染色体、核型及模式图见图1、图2及图3。染色体参数分析结果表明，野生和栽培盾叶薯蓣的最长与最短染色体之比(Lt/St)均为2.03~2.19，核型类型均为Stebbins2B型，属于较对称类型。野生和栽培盾叶薯蓣的核型还存在显著区别。野生盾叶薯蓣的染色体数目2n=20，而栽培盾叶薯蓣的均为2n=4x=40。从核型组成上看，野生盾叶薯蓣只有中部着丝粒和近中部着丝粒的染色体，没有近端部着丝粒染色体，其中中部着丝粒的染色体占70%，近中部着丝粒染色体占30%;而栽培株系，均有1对近端部着丝粒染色体，中部着丝粒染色体占40%~50%，近中部着丝粒染色体占50%~55%。野生盾叶薯蓣的染色体臂比大于2的比率(P.C.A)为0.3，而栽培盾叶薯蓣的P.C.A约为0.35~0.45;野生盾叶薯蓣的核型不对称系数As.K.C(%)为61.98%，而栽培株系为63.44%~65.97%;野生盾叶薯蓣的染色体相对长度约为6.51%~12.33%，而栽培株系约为3.31%~6.92%;从染色体长度上看，野生盾叶薯蓣没有L染色体，主要为M1、M2及S染色体，而栽培株系有L、M1、M2及S染色体。虽然4个栽培株系均为四倍体，核型上有相同之处，但也存在较大差异。从核型组成上看，株系A02-6有10对中部着丝粒染色体、9对近中部着丝粒染色体、1对近端部着丝粒染色体;株系A05-6有8对中部着丝粒染色体、11对近中部着丝粒染色体、1对近端部着丝粒染色体;株系A09-2-1有9对中部着丝粒染色体、10对近中部着丝粒染色体、1对近端部着丝粒染色体;株系‘红卫’有8对中部着丝粒染色体、11对近中部着丝粒染色体、1对近端部着丝粒染色体。株系A05-6与‘红卫’的核型组成相同，但它们的核型不对称系数As.K.C(%)却不同，株系A02-6、A05-6、A09-2-1和‘红卫’分别为64.37%、65.97%、65.05%和63.44%。从染色体长度上看，株系A02-6为2L+7M2+9M1+2S、株系A05-6为2L+6M2+11M1+1S、株系A09-2-1为2L+7M2+10M1+1S、株系‘红卫’为3L+6M2+10M1+1S。

3讨论

染色体可以为植物进化和系统发育研究提供有价值的信息［12］。根据染色体的长度及其形态特征,依次进行编号、配对,计算染色体相对长度、臂比，并确定着丝粒位置等，可以阐明生物染色体组的构成，为种质资源鉴定提供细胞学依据［13］。本研究结果表明，野生及栽培盾叶薯蓣的核型类型均为Stebbins2B型，均属于较原始类型。统计分析表明(表4)，染色体长度比和臂比大于2的比率在盾叶薯蓣的不同株系间没有显著差异，陕西种源与云南种源的盾叶薯蓣在平均臂比和核型不对称系数存在显著差异。盾叶薯蓣虽为我国特有，分布不是很广，但物候特征差异很大，因此其在长期与环境的适应中，形成了盾叶薯蓣核型的多样性［14］，因此，盾叶薯蓣的核型差异与地理位置、气候因素及土壤因素有一定的关系。本研究的4个栽培株系虽均为四倍体、核型类型均为2B，但它们在核型组成、不对称系数As.K.C(%)、染色体相对长度以及其它核型参数方面均存在差异。Coursey［15］认为“在薯蓣的栽培品种中，已知的变异是如此的巨大，以至把存在的最好的性系简单地进行选择并加以传播，就有许多工作可做了”。这里的薯蓣栽培品种主要指D.rotundata和D.alata等食用薯蓣。本研究结果表明，盾叶薯蓣不仅存在广泛的形态多样性［14］，同时存在染色体倍性及核型的变异，不仅在二倍体与四倍体间，而且在同为四倍体的不同株系间，其核型均存在较大差别，说明盾叶薯蓣是一个非常复杂的遗传群体。植物多倍体利用是药用植物育种的重要途径之一。第一，多倍体往往表现出器官的巨大性，而大部分药用植物以根、茎、叶等营养器官为收获部位，因此通过多倍体培育，可提高药用植物的产量;第二，染色体加倍产生的剂量效应可上调控制次生代谢产物基因的表达，增加植物次生代谢产物的量，这对于药用植物育种具有重要意义。因此，多倍体在药用植物育种中日益受到重视，已在包括盾叶薯蓣在内的多种药用植物中诱导产生多倍体［16－18］。李运合等［18］对盾叶薯蓣人工四倍体植株与普通二倍体植株进行比较，结果表明四倍体植株体型大、具生长优势，离体条件下利用愈伤组织块诱导多倍体是盾叶薯蓣倍性育种的一条有效途径。周媛等［19］的研究表明四倍体盾叶薯蓣在生长势、生长适应性和有效成分含量上有较大的优势，是进一步培育高含量薯蓣皂苷元新品种的有价值的育种材料。但董静洲等［20］的研究却得到相反的结果，即四倍体在薯蓣皂苷元含量等方面没有提高反而有所下降。目前主要是在离体条件下，用秋水仙素诱导体细胞加倍来获得同源四倍体。董志渊等［21］在产自云南漾濞、永胜的盾叶薯蓣中观察到5个自然三倍体变异类型，经对株系性状进行评价，获得了表现优良的三倍体株系。本研究中，从云南各地及陕西安康收集的盾叶薯蓣株系中，仅野生种为二倍体，其余多年栽培的盾叶薯蓣株系均为四倍体，这可能是由于人工栽培时定向选择根状茎巨大、产量高、长势好的单株进行繁殖的结果。目前盾叶薯蓣野生资源濒临枯竭，种质衰退极其严重，皂苷元含量急剧下降，对于药用植物来说，可以利用其多倍体的巨大性提高产量，利用旺盛的新陈代谢能力来提高有效成分含量。本研究结果表明，在盾叶薯蓣的自然栽培群体中存在一定比例的多倍体变异类型，因此我们可以利用这一变异类型进一步培育高含量薯蓣皂苷元新品种。