榕小峰育幼繁殖特点分析

本文作者：李宗波、杨培、彭艳琼、杨大荣 单位： 西南林业大学林学院、云南省森林灾害预警与控制重点实验室、中国科学院西双版纳热带植物园

榕树是榕属(Ficus,Moraceae)植物的总称，大约有800多种，几乎每一种榕树都必须依赖其特定的传粉榕小蜂为其传粉，双方已形成种类高度专一、相互依赖的“传粉育幼繁殖系统”［1－3］。因此，在如此严密的育幼繁殖系统中，榕树花期和传粉榕小蜂的相遇是至关重要的一步。很多研究已经证明榕果气味能够促进双方的相遇［4－11］。榕果呈“坛型”，顶端有一与外界相联系的唯一通道———苞片口，果腔内壁着生大量的雌性小花，榕果具有5个发育阶段［12］:雌花前期(Pre-femalephase)、雌花期(Femalephase)、间花期(Inter-floralphase)、雄花期(Malephase)和后雄花期(Post-floralphase)，仅有雌花(也称接受期)的榕果苞片口会主动打开并允许传粉榕小蜂进入。在另一方面，榕树种类繁多，生态分布重叠严重，榕果接受期的时间短［2－3］，传粉榕小蜂寿命也较短［13－15］。因此，对于榕蜂“传粉育幼繁殖系统”稳定共存来说，雌花期榕果特异性化学信号的产生是其关键。在榕蜂“传粉育幼繁殖系统”中，还存在大量的非传粉榕小蜂，也被认为与寄主榕树间存在专一性的对应关系［16］。非传粉榕小蜂通常从果壁外将卵产在雌性小花内，随着榕果发育而发育。在榕果内，几乎所有非传粉榕小蜂与传粉榕小蜂同步完成发育，并随着传粉榕小蜂从榕果内扩散出去，开始搜寻新的寄主，这种搜寻过程与非传粉榕小蜂准确识别不同阶段、不同时期榕果挥发物有关［17］。我们在西双版纳地区观察到两种非传粉榕小蜂Diaziellayangi和Lipothymussp.能够进入钝叶榕雌花期榕果［18］，并推测这两种非传粉榕小蜂与传粉榕小蜂Eupristinasp.均是利用雌花期榕果挥发物来进行寄主搜寻与识别的，因此，对榕树雌花期和榕小蜂进入榕果后挥发物的成分进行分析有重要意义。本文用顶空动态法提取了钝叶榕雌花期及3种进果榕小蜂进入榕果后的挥发物，并进行了分析和鉴定，为揭示榕蜂“传粉育幼繁殖系统”的化学信息联系与分配机制奠定基础。

1材料和方法

1．1材料钝叶榕(FicuscurtipesCorner)为雌雄同株榕树，榕果成对腋生，无总梗，球形至扁球形，顶部平压，苞片小而闭合，略微凹陷，果实成熟时呈紫红色［19］。花期9－11月，雌花期1－2周，伴随着青果的香味，传粉后，青果气味消失。

1．2榕果挥发物的收集采用顶空动态法收集榕果挥发物。首先用120目纱网袋将刚着生的榕果隔离，以防止非传粉榕小蜂产卵或传粉榕小蜂进入。待闻到青果香味时，揭开纱网袋，使用PET无味透明塑料袋(KalleNaloGmbH,WursthüllenLtd.,German)将接受期的榕果包裹，袋的两端设进气口和出气口，使用特氟隆管(PTEE,VICIJourLtd.,Sweden)连接。进气口速度400mLmin－1，出气口速度300mLmin－1，收集时间3h，采样时间为12∶30－15∶30。进气端使用活性炭(ORBOTM-32,Bellefonte,PA,SupelcoLtd.,USA)过滤，出气端接吸附管(30mgAlltechSuper-Q,Gainesville,Florida,ARSLtd.,USA)。传粉后的榕果，即Eupristinasp.,Diaziellayangi和Lipothymussp.进入榕果3d后，采用相同的方法收集。采集完毕的吸附管用100μL正己烷(色谱纯,Tedia,USA)分别洗涤3次，并将洗涤液收集在2mL容量的棕色试剂瓶内，置于冰箱内(－18℃)保存待用，保存时间不超过1个月。

1．3榕果挥发物的分析为进行样品的定量测定，加入正辛烷(Octane，0.702gcm－3)和乙酸癸酯(Decylacetate,0.865gcm－3)2种内标化合物，按300ngμL－1加入内标化合物。采用GC(AgilentHP5890)和GC-MS联用仪(AgilentHP6890/5973MS和FinniganTranceGC2000/TraceDSQMS)分析榕果挥发物，检测器为火焰离子检测(FID)。GC分析条件是取5μL样品由注射器加入进样口，采用非极性石英柱HP-5(30m×0.32mm×0.25mm)，进样采用50∶1的分流模式。炉温升温程序为:50℃保持1min，然后以3℃min－1升温至250℃，再以20℃min－1升至280℃。GC-MS分析条件是取1μL样品由注射器加入进样口，气相色谱柱型号为极性HP-5MS型石英柱(30m×0.32mm×0.25mm)，进样采用10∶1的分流模式，升温程序为:30℃保持4min;然后以3℃min－1升温至180℃，再以20℃min－1升至240℃，柱流量1.0mLmin－1，柱前压100kPa。MS离子轰击源设为扫描功能，扫描范围35~450amu，电离方式EI，电子能量70eV，传输线温度250℃，离子源温度230℃，四级杆温度150℃。化合物的鉴定首先是利用仪器自带的标准谱库(Wiley7n.1)检索目标化合物，然后依据保留指数并参阅相关文献资料加以确定。

1．4数据分析和处理数据分析采用SPSS统计分析软件(Version11.5)。所有的百分率数据在分析前进行arcsin(x－1/2)转换，化合物的绝对含量进行Log(x+1)转换。利用配对样本t-test检验雌花期和传粉后挥发物的相对含量，利用单因素方差分析中的Tukey's方法检验雌花期和传粉前后的挥发物的绝对量。为了检验各主要挥发物成分(>5%)对特异性信号构建的贡献程度，用MVPS软件(Version3.3)进行了主成分分析。此外，为了对比不同样本间挥发物的空间异质性，采用R统计分析软件(Version2.10)中Vegan数据包进行多反应序列程序(Multipleresponsepermutationprocedure,MRPP，Permutation设定为10000)检验［5,20］。

2结果和分析

2．1钝叶榕榕果挥发物的成分钝叶榕榕果挥发物共鉴定出45种成分，包括脂肪酸衍生物、单萜类、倍半萜类和莽草酸途径生成的化合物(表1)。雌花期榕果共检测到35种挥发物，主要是6-甲基-5-庚烯-2-酮(10.66±10.10)%、α-金合欢烯(18.05±3.76)%、顺-β-金合欢烯(19.35±1.81)%、β-罗勒烯(21.48±10.80)%和4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯(12.21±4.13)%，含量占总量的80%;传粉后榕果发现43种成分，以α-派烯(6.50±0.40)%、香桧烯(12.04±1.20)%、β-罗勒烯(6.82±5.51)%和顺-β-香柠檬烯(23.52±4.12)%和大香叶烯D(5.05±0.89)%为主，约占总量的50%。

2．2单个榕果挥发物释放量雌花期时，钝叶榕榕果挥发物释放量相对较高，为(1.01±0.15)ngh－1fig－1;传粉后，挥发物释放量显著降低，为(0.22±0.09)ngh－1fig－1(F1,5=84.56，P<0.001)。

2．3雌花期与传粉后化合物类别的变化无论是雌花期还是传粉后，钝叶榕榕果化合物主要以单萜类和倍半萜类为主，含量基本相当，雌花期分别为(53.66±30.64)%、(42.92±11.19)%;传粉后分别为(41.69±18.18)%、(39.99±11.35)%。但传粉后，这两类化合物均呈降低的趋势，但变化不明显(单萜类:t=1.03，P=0.411;倍半萜类:t=0.09，P=0.937)，而脂肪酸衍生物变化不明显(t=0.397，P=0.73)，莽草酸途径合成的化合物有明显升高的趋势(t=－12.26，P=0.007)(图1)。

2．4雌花期和传粉后主要挥发物的变化图2显示了钝叶榕榕果挥发物中主要挥发性成分的变化情况。雌花期时，6-甲基-5-庚烯-2-酮、β-罗勒烯、反-β-金合欢烯和α-金合欢烯的含量最高;传粉后，这些化合物含量显著降低(P<0.05)，而另外一些化合物含量明显增加，如α-派烯、香桧烯、顺-β-罗勒烯、反-β-香柠檬烯和大香叶烯D。还有一些化合物，如4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯的变化不明显(t=1.252，P=0.337)。此外，传粉后也出现了很多含量甚微的新型挥发性化合物，如月桂烯、α-愈创木烯等，这些化合物可能利于驱避传粉榕小蜂远离。主成分分析表明这些挥发物对钝叶榕榕果特异性信号贡献较大，第一载荷因子大于0.3的化合物均是传粉后含量变化较剧烈者(表2)。

2．5雌花期和传粉后榕果挥发物的空间分布利用多反应序列程序对钝叶榕榕果挥发物释放量进行了显著性检验，结果表明，传粉后榕果挥发物释放量显著减少(A=0.15,P=0.0019)，且不同样本间存在着空间上的差异性(A=0.21，P<0.001)(图3)。

3讨论

3．1榕果挥发物的构成特征Grison-Pigé等［21］将榕树榕果挥发物的性质分为泛化性(Generalization)和专化性(Specialization)两种，依赖化学成分之间的种类、配比实现挥发物特异性的称为泛化性，依赖特殊化学成分实现特异性的称为专化性。但是，在目前鉴定的40多种榕树雌花期挥发物中，认为是特殊挥发物的有37种，但仅有6种成分含量在4%~10%，其它化合物的含量均<1%。Knudsen等［22－23］归纳了利用顶空动态收集的38目90科991物种1700多种花香成分，认为具有专一的化合物并未在任何榕树种类中发现，即榕树榕果挥发物均是一些常见的化合物种类。鸡嗉子榕(F.semicordata)是目前唯一认为通过高含量4-对苯甲基醚，以自私通道形式(Privatechannel)引诱传粉榕小蜂到来传粉或产卵的［5,24］，但4-对苯甲基醚并非罕见的化合物，其也存在于蔷薇科(Rosaceae)、兰科(Orchidaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、番荔枝科(Annonaceae)等17科植物中［24］。若鸡嗉子榕唯一依赖4-对苯甲醚，这对于鸡嗉子榕“榕蜂传粉育幼繁殖系统”稳定共存是非常危险的。在我们深入分析鸡嗉子榕榕果挥发物过程中，发现榕果挥发物中含量低微的吲哚具有相当高的生物活性，其电生理(EAG)、行为测定及野外诱捕能力超过4-对苯甲基醚，且两者间具有增盈效应(未公开的数据)。因此，我们有理由相信榕树与其传粉榕小蜂间关系的维持主要依赖常见的挥发物种类。钝叶榕榕果也符合泛化性的特征，其挥发物及其主要化合物种类(表1，图2)并未有罕见的化合物。

3．2榕果挥发物的时间与空间的异质性榕果雌花期挥发物是维持“榕蜂传粉育幼系统”稳定共存的关键信号，其挥发物的变化状况，如传粉后降低、消失或增高的化合物，可反映化合物的生物活性［6,8］，如传粉后含量降低的芳樟醇，可能驱动传粉榕小蜂远离［6,25］。钝叶榕榕果主要挥发物含量变化明显的化合物，如6-甲基-5-庚烯-2-酮、β-罗勒烯、反-β-金合欢烯、α-金合欢烯、α-派烯、香桧烯、顺-β-罗勒烯、反-β-香柠檬烯、大香叶烯D和4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯等可能是筛选钝叶榕化学活性物质的基础。昆虫对活性化学物质的反应具有一定的阈值范围。在阈值范围之内，昆虫对化合物具有反应，趋近或是远离;高于或低于阈值范围，昆虫将没有任何行为反应［26］。雌花期榕果产生的挥发物含量最高［9,27－28］，且不同种榕树榕果的挥发物释放量有明显差异，如钝叶榕榕果和对叶榕(F.hispida)榕果［28］，推测榕果挥发物释放量的变异程度应在传粉榕小蜂行为阈值之内。而另一方面，钝叶榕榕果挥发物的空间异质性(图3)，可能促使不同地理分布的钝叶榕产生种内特异性化学成分的差异，这已在对叶榕和聚果榕(F.racemosa)上得到了证明［29］。钝叶榕分布于孟加拉国、尼泊尔、越南、不丹、泰国、印度、锡金、印度尼西亚、缅甸、马来西亚以及我国的贵州、云南等地，生长于海拔530~1350m的地区［19］，其地理跨度之大，环境之复杂，远远高于对叶榕和聚果榕。因此，钝叶榕榕果挥发物可能存在地理变异。一般来说，从母树出来的传粉榕小蜂需经历长距离的飞行才能发现接受期的榕果［30］。那么，传粉榕小蜂如何识别不同空间、不同地理分布的寄主特异性化学信号?下一步结合GC-EAD技术和行为测定将有助于揭示榕蜂育幼繁殖系统间化学信息的联系与分配机制。