HPLC研究藜芦-丹参配伍后藜芦定的含量

（三峡大学 护理学院，湖北 宜昌 443000）

摘 要：目的：研究藜芦药材及丹参-藜芦配伍后藜芦主要化学成分的变化。方法：采用hplc法测定藜芦定的含量，比较配伍前后对二者的影响；色谱条件：Diamonsil-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇-水-0.1M醋酸铵溶液（59∶1∶40），柱温：25℃；检测波长：220nm；流速：1mL•min-1。结果：在0.292～1.460μg•mL-1范围内线性关系良好（r=0.9998，n=5），平均回收率为95.17%，RSD=1.44%（n=5）；丹参配伍后藜芦定的含量升高，显示其毒性增加。结论：该方法简便，标准客观，可供参考。

关键词：配伍；十八反；化学成分；丹参；藜芦

中图分类号：R284.2文献标识码：A文章编号：1673-2197（2009）01-0017-02

丹参为唇形科植物丹参的干燥根及根茎，主要含有丹参酮ⅡA、隐丹参酮及丹酚酸B具有活血调经、祛瘀止痛、养心安神等功效，在抗心脑血管疾病、抗衰老、抗肿瘤等方面有重要应用。

藜芦为百合科植物藜芦的干燥根，主要功效为催吐、祛痰、杀虫。主要含有生物碱类成分，其中以藜芦定含量较多，小剂量时具有一定的降压作用，而剂量较大时则成为一种脂溶性神经毒素，能引起神经肌肉兴奋，心律不齐等。

目前研究“十八反”“十九畏”的综述性文章较多，但从化学成分的角度研究“十八反”“十九畏”药物配伍的较少，尤其在临床上丹参和藜芦属于相反配伍，而关于两者配伍的实验性研究尚未见报道。笔者在参考相关文献的基础上，采用HPLC法对丹参、藜芦各自单煎剂及二者的共煎剂中主要化学成分的变化情况进行了研究，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Dionex-P680液相色谱仪（德国戴安公司，四元泵，UVD170U检测器，Chromeleon色谱工作站），AT-201电子分析天平（d=0.01mg，瑞士），SK5200H超声波清洗机（上海科导超声仪器有限公司），北京医用离心仪LD5-10，KMD型电热套（山东省鄄城永兴仪器厂）。

1.2 试剂和试药

藜芦定对照品（verartidine，含量≥95%，美国chromadex公司，批号：94838-2007584），丹参酮ⅡA对照品（供含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号：110766-200417），丹酚酸B对照品（供含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号：111562-200605），甲醇（美国Fisher公司，色谱纯），已腈（美国Fisher公司，色谱纯），醋酸铵（武汉市无机盐化工厂，分析纯），甲酸（上海振兴，分析纯），水为娃哈哈纯净水。其它试剂均为分析纯。藜芦（购于安徽省毫州沪谯饮片厂），经湖北中医学院生药学教研室陈科力教授鉴定为百合科植物藜芦的干燥根） 。丹参（购于湖北省中药饮片厂），经湖北中医学院生药学教研室陈科力教授鉴定为唇形科植物丹参的干燥根及根茎）。

2 方法与结果

2.1 色谱分析条件

色谱柱：Diamonsil-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇-水-0.1M醋酸铵溶液（59：1：40），柱温：25℃；检测波长：220nm；流速：1mL•min-1。在本色谱条件下，理论板数按藜芦定峰计算应不低于3000。藜芦定峰与杂质峰的分离度应符合要求。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取藜芦定对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.146mg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

藜芦单煎剂的制备：取藜芦约10g，参照藜芦丹参共煎剂的制备方法制备，即得藜芦单煎液供试品。藜芦丹参共煎剂的制备：取藜芦和丹参各约10g，置圆底烧瓶中，加入80mL水，加热回流3h，滤过，榨取药汁，合并。置电热套中浓缩至四分之一体积。加入甲醇20mL，超声处理（功率150W，频率20KHz）1h，取出，放冷，摇匀，离心30min，滤过，转移至50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）过滤，取续滤液，即得。

2.4 标准曲线的制备

精密吸取上述对照品溶液2、4、6、8、10μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，以相应的峰面积积分值对进样体积进行线性回归，得到回归方程：y=1.2369x-0.2490，（r=0.9998，n=5），线性范围为0.292mg～1.460mg。

2.5 精密度试验

吸取上述对照品溶液5μL，按上述色谱条件，连续进样6次，结果峰面积积分值分别为5.7959、5.8669、5.6901、5.7767、5.5363、5.5365 RSD（n=6）=2.44％。

2.6 稳定性试验

取上述供试品溶液，按上述色谱条件测定，于8h后测定，结果表明，供试品溶液在8h内稳定性良好。

2.7 加样回收率

藜芦定对照品溶液的制备：取藜芦定对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含1.26mg的溶液，即得。

加样回收供试品溶液的制备：精密称取已知含量的藜芦药材样品5份，各约5g，分别精密加入上述藜芦定对照品溶液1mL，照“供试品溶液的制备”下方法制备，制备加样回收供试品溶液，照“藜芦定测定条件”下依法测定，测得加样回收率为95.17%，RSD为1.44%。结果见表1。

2.8 含量测定

（1）藜芦单煎剂中的藜芦定的含量测定：分别精密吸取藜芦定对照品溶液和藜芦单煎液供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，单煎剂中藜芦定的平均含量为0.102mg•g-1。

（2）丹参藜芦共煎液中藜芦定的含量测定：分别精密吸取藜芦定对照品溶液和藜芦共煎液供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，共煎剂中藜芦定的平均含量为0.302mg•g-1，RSD=0.76%（n=3）。见图1。

从上述结果可以看出：丹参藜芦共煎液中含有藜芦定较高。说明丹参和藜芦配伍后使毒性成分藜芦定的含量增加，从而使藜芦定产生的神经毒素增加。

3 讨论

（1）本课题主要从化学角度采用HPLC法研究丹参、藜芦各自水煎液及二者的共煎液中藜芦定的含量变化，发现丹参和藜芦配伍后的毒性成分藜芦定含量增加，使神经毒素增加，对人体产生更大的危害。综上所述，本研究为丹参反藜芦提供了科学的理论依据，便于更好地指导中医临床安全用药。

（2）单味中药是一个复杂体系，难于分离和分析，配伍后化学成分的分离和分析就更困难了。因此建立一种重现性好的分析方法是研究中药配伍的必要手段。我们建立了一套重现性好、稳定性高的液相色谱分析方法来研究丹参藜芦配伍后的共煎液中藜芦定的含量变化，并且根据单煎液和共煎液中藜芦定在相应的保留时间处进行了对比，由以上数据和图谱可知配伍后藜芦定色谱峰发生了含量上的变化。由此可以说明中药配伍后的化学成分并非是单味药化学成分的简单加和，煎煮过程中复方有化学成分含量的变化。

（3）本文在对共煎液中藜芦定进行含量测定时，考察了供试品溶液在不同流动相体系下的色谱分离行为。曾以甲醇-水（60∶40）为流动相，柱温：25℃；检测波长：220nm；流速：1mL/min为条件进行了研究，结果藜芦定色谱峰的分离度没有达到理想的要求，并且有拖尾现象。在此基础上，调整流动相比例，并且加入了醋酸铵改善峰形，最后确定了以流动相：甲醇-水-0.1M醋酸铵溶液（59∶1∶40），柱温：25℃；检测波长：220nm；流速：1mL/min的色谱条件，在此条件下，藜芦定分离度达到了理想的要求，峰形左右对称，各成分基本达到基线分离。

（4）在供试品溶液的制备时，为了跟临床实际用药相符合，模拟加水煎煮药的方法和煎煮药的时间，采用了直接用水加热回流的方法，滤过，榨取药汁。然后浓缩至四分之一体积，加入甲醇超声处理1h进行供试品溶液的制备。

（5）中药成分非常复杂，同一成分在不同时间测定的色谱保留时间可能会有误差，仅通过比较色谱保留时间来判别色谱峰的异同有可能产生误判，若同时使用色谱峰保留时间或者采用指纹图谱形式，可以考察更多化学成分的变化情况，提高判断的准确性。因此该实验项目还有待于进一步地研究。

参考文献：

［1］ 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典［M］.一部. 北京：化学工业出社，2005：52.

［2］ 张红霞，毋拥军.略析“诸参辛芍叛藜芦” ［J］. 中兽医学杂志，2006（3）：43-45.［3］ 潘浪胜，吕秀阳，吴平东，等.反相高效液相色谱法测定藜芦生物碱中藜芦定的含量研究［J］.中医药导报，2005，11（5）：3-5.

［4］ 靳艳卿，段世民，王均，等. 侧脑室注液河豚毒素和藜芦定对大鼠异氮醚MAC的影响［J］.中华麻醉学杂志，2000，20（5）：305-307.

［5］ 刘青，邓毅，宁艳梅，等. 中药“十八反”配伍研究进展［J］.甘肃中医，2007，20（11）：11-12.