α—黑素细胞刺激素对EAE豚鼠外周血单个核细胞分泌IL—4、IFN—γ水平的影响

摘要：目的 通过研究α-黑素细胞刺激素（α-MSH）对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）豚鼠分泌IL-4、IFN-γ水平的影响，探讨α-MSH对EAE发病有无保护作用。方法 40只雌性豚鼠分为正常对照组、EAE对照组和EAE高、低剂量治疗组。两治疗组自造模前7 d始分别按1 mg/Kg/d及0.25 mg/Kg/d予腹腔注射注射α-MSH直至试验结束。观察豚鼠神经功能障碍评分变化，测定IL-4、IFN-γ水平。结果 ①α- MSH治疗组神经功能障碍评分较EAE对照组显著降低（P

关键词：α-黑素细胞刺激素；脑脊髓炎；实验性自身免疫性；白细胞介素-4；γ-干扰素

实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）是经典的多发性硬化动物模型。目前研究认为EAE发病机制免疫失衡有关，Th1型细胞因子-γ干扰素（IFN-γ）与Th2型细胞因子白细胞介素-4（IL-4）在其发生发展过程中起着重要的作用[1]。

α-黑素细胞刺激素（Alpha-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH） 是一种前阿片促皮质激素原（Proopiomelanocortin，POMC）衍生肽，一系列动物实验表明α-MSH对皮炎、炎症性肠病、支气管哮喘等多种炎症性疾病具有治疗作用[2-3]，但国内尚无用于EAE和MS的相关报道。本研究试图通过观察α-MSH对EAE神经功能障碍评分及相关细胞因子的影响，探讨EAE发病及α-MSH治疗EAE的机制。

1资料与方法

1.1实验动物及主要实验试剂 250～300 g雌性健康豚鼠40只和健康SD大鼠5只； 福氏完全佐剂（complete Freud's adjuvant，CFA）、α-MSH、鼠IL-4、IFN-γ ELISA试剂盒；淋巴细胞分离液[比重（1.07土0.002）g/mL]等。

1.2方法

1.2.1动物分组及处理 40只雌性豚鼠随机分为4组，正常对照组、EAE对照组、EAE低剂量治疗组、EAE高剂量治疗组，每组各10只。取SD大鼠脊髓制成脊髓冰生理盐水匀浆，再与等量福氏完全佐剂混合，反复抽打制成粗制髓鞘碱性蛋白（crude myelin basic protein，cMBP），将其注入需造模豚鼠双侧后足掌皮下各0.3 mL制造EAE模型。用PBS液稀释α-MSH成0.25 mg/mL、1 mg/mL两种浓度的溶液，EAE低、高剂量治疗组自造模前7 d始分别予腹腔注射注射α-MSH；EAE对照组及正常对照组分别同时腹腔注射等体积PBS液和生理盐水，直至实验终止。造模成功后，每天同一时间对豚鼠进行神经功能障碍评分。评分标准：无明显异常0分，后肢轻瘫1分，后肢完全瘫痪2分，后肢全瘫伴前肢不完全瘫痪3分，四肢完全瘫痪或死亡为4分。各EAE组动物均造模成功，观察3 d症状不再加重为发病高峰期处死动物；正常对照组动物4 w后处死。

1.2.2 IFN-γ、IL-4水平的测定 将肝素抗凝的眶静脉血分离单个核细胞，调成2×106/mL的浓度，用RPMI-1640培养液悬浮，在上述淋巴细胞悬液中加入1mg/ml的PHA，充分混匀后加入24孔培养板中，然后置于5%的CO2，37℃的细胞培养箱中培养6 h，ELlSA法检测IFN-γ、IL-4水平（按说明书方法进行检测）。

1.3统计学处理 采用SPSS15.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，进行单因素方差分析；组间两两比较用LSD法；变量间相互关系采用Pearson直线相关分析。以P

2结果

2.1神经功能障碍评分 各造模组均有不同程度发病，正常对照组豚鼠未发病。EAE对照组（3.4±0.6）分，EAE低剂量治疗组（2.7±0.7）分，高剂量治疗组（2.1±0.6）分，两治疗组神经功能障碍评分低于EAE对照组（P

2.2各组豚鼠外周血单个核细胞分泌 IFN-γ、IL-4水平的比较，见表1。

2.3 EAE对照组及高、低剂量治疗组发病高峰期IFN-γ/IL-4比值与神经功能障碍评分相关性分析 EAE对照组及两治疗组发病高峰期外周血IFN-γ/IL-4比值与神经功能障碍评分呈正相关（r=0.89，P

3讨论

Th1细胞主要参与细胞免疫，介导与细胞毒性和迟发型超敏反应有关的免疫应答；Th2细胞主要参与体液免疫应答。Th1细胞分泌的主要细胞因子有IL-2、INF-γ和肿瘤坏死因子-β（tumor necrosis factor-β，TNF-β）等，这些细胞因子能够触发细胞免疫，使炎性细胞转移至CNS内从而加剧髓鞘破坏过程；Th2细胞则主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等细胞因子，具有抗炎作用，因而认为MS是Th1介导的细胞免疫为主的疾病[1]。正常情况下，Th1和Th2细胞及其分泌的细胞因子处于动态平衡中，并受到机体的严格调控，各种原因导致Th1/Th2细胞因子失衡可导致自身免疫性疾病（如多发性硬化，类风湿性关节炎）的发生[4-6]。

本实验中，通过对EAE豚鼠外周血中最具代表性的Th1、Th2型细胞因子IFN-γ及IL-4的检测，结果发现在发病高峰期，EAE对照组豚鼠外周血单个核细胞分泌IFN-γ水平比正常对照组显著增高（P

多种肽类激素具有一定免疫保护作用，而α-MSH是一种POMC衍生肽，其受体分布广泛，除黑色素细胞外还分布于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞，表明α-MSH应该对机体免疫功能有一定影响。研究发现α-MSH可以减轻棒状杆菌和脂多糖诱导的肝炎的炎性强度；抑制接触型皮炎的激发，引起特异的半抗原耐受；对支气管哮喘、脉管炎、炎症性肠病等多种免疫性疾病具有抑制发生或减轻损害作用[2-3]。本实验结果显示，α-MSH能够减轻EAE豚鼠发病高峰期神经功能障碍评分，说明α-MSH对EAE发病具有一定保护作用，通过进一步测定Th1、Th2型相关细胞因子发现α-MSH能够剂量依赖性地减少EAE豚鼠发病高峰期PBMC的IFN-γ分泌水平，增加分泌IL-4分泌，表明调节Th1/Th2细胞平衡可能是α-MSH发挥其免疫保护作用的靶点之一，即通过抑制Th1细胞的增殖分化，促进Th2细胞的功能来达到防治EAE发生发展的作用。我们的结果也与Taylor[7]等的报道一致，即α-MSH可通过促进效应性T细胞极化方向的改变达到免疫调节作用。

目前尚无理想的药物来阻止MS病情进展，其它免疫治疗药物因费用昂贵及毒副作用大等原因难以推广，而α-MSH及其衍生物毒性低，副作用轻微，有良好的依从性，并且免疫调节作用强而广泛，无明显不良反应[9-11]，具有潜在的临床应用前景。

参考文献：

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[2]Luger TA， Brzoska T. Alphα-MSH related peptides：a new class of anti-inflammatory and immunomodulating drugs[J]. Ann Rheum Dis，2007， 11（3）：52-55

[3]Brzoska T， Luger TA， Maaser C， et al. Alpha-melanocyte-stimulating hormone and related tripeptides：biochemistry， antiinflammatory and protective effects in vitro and in vivo， and future perspectives for the treatment of immune-mediated inflammatory diseases[J]. Endocr Rev，2008，29（5）：581-602

[4]何维，高晓明，曹雪涛，等.医学免疫学[M].北京：人民卫生出版社，2005：16-17.

[5]赵武述.免疫平衡研究及其临床意义[M].北京：科学出版社，2005：100-101.

[6]Kidd P. Thl/Th2 Balance： The Hypothesis， its limitations， and Implications for health and disease[J].Altern Med Rev，2003，8（3）：223-246.

[7]Taylor A， Namba K. In vitro induction of CD25+ CD4+ regulatory T cells by the neuropeptide alpha-melanocyte stimulating hormone （alpha-MSH） [J]. Immunol Cell Biol， 2001，79（4）：358-67.编辑/张燕