CTLA4

【关键词】 器官移植

【摘要】 CTLA4Ig是一种融合免疫球蛋白，可以选择性地阻断CD28与B7的信号传导通路，导致T细胞免疫失能，诱导对特异性抗原的免疫耐受. 本文介绍了其生物学特性、免疫诱导耐受机制及在异体移植方面的研究进展和局限性，其在异体移植方面展示了良好的应用前景.

【关键词】 CTLA4Ig；器官移植；免疫耐受

0引言

异体器官移植最重要的并发症是免疫排斥反应，虽然各种新型的免疫抑制药物，如FK506、麦考酚酯、雷怕霉素及针对T细胞的单克隆抗体（如OKT3）等在临床应用中显示了良好的效果，但是这些免疫抑制剂均或多或少的损害了T细胞的功能，导致继发很多不良反应，包括感染、恶性肿瘤、器官毒性损伤和需要终生服用等，限制了异体移植的广泛应用. 一个迷人的方法免疫耐受展示了良好的前景［1-3］. 目前很多实验显示应用CTLA4Ig阻断CD28/B7通路可以获得对特异性抗原的免疫耐受，在异体移植免疫治疗中展示了良好的前景. 下面就对CTLA4Ig在移植免疫学中的相关研究进展进行综述.

1CTLA4Ig的生物学特性

CTLA4Ig是通过基因重组产生的CTLA4（细胞溶解性T淋巴细胞相关抗原cDN，又名CD152）分子胞外功能区与免疫球蛋白IgG恒定区相结合的融合蛋白,与B7分子具有高度的亲合力（其亲和力约为CD28的20倍），可以和CD28竞争结合APC（抗原提呈细胞）上的B7家族分子CD80 (B71)和 CD86 (B72)， 阻断CD28与B7的信号传导通路，抑制T细胞对抗原识别第二信号的产生，导致T细胞的免疫失能，诱导对特异性抗原的免疫耐受，从而发挥免疫抑制效应.

在发现CTLA4Ig具有诱导免疫耐受的功能以后，很多人对鼠、猴等动物的药代动力学进行了研究，发现肌肉或皮下注射0.29 g/kg以上的CTLA4Ig后，其半衰期为90~140 d，可以较长时间的发挥疗效. 他们同时发现不同的注射途径不影响药物的消除特性，其半衰期与注射次数、剂量虽然有一定的关系，但变化不明显［4］.

2诱导免疫耐受的机制

2.1抑制T细胞的活化和效应过程初始型T细胞的活化至少需要两种信号，第一种信号是抗原特异性的，由异体抗原或自身MHC（主要组织相容性复合体）处理的抗原与TCRCD3（TCR，T细胞受体）复合物的结合；第二信号是抗原非特异性的，是由APC和T细胞上多种辅助分子配体对（共刺激分子）的相互作用而提供的. 当TCR与抗原结合后，共刺激分子缺乏，将导致T细胞对特异的抗原表现为无能状态，不仅不能被激活，而且对所有活化的信号均不应答. 其中，APC上的B7家族分子和T细胞上的配基CD28/CTLA4的结合对T细胞的活动起着重要的调节作用,阻断此信号通路,可以干扰T细胞的活动. 当CD28与B7分子结合并活化后,可在基因转录前和转录后两个水平上介导IL2的产生. IL2是促使T细胞活化、增殖的关键性因子, T细胞可以自分泌和旁分泌的形式产生IL2，作用于细胞表面的受体IL2R，刺激T细胞MHCⅡ类抗原的表达,并产生IFNγ, TNFα等多种细胞因子,发挥效应功能. 而CTLA4Ig与B7的亲和力较CD28高20倍,能与CD28竞争性结合B7分子,一方面阻断共刺激通路,影响T细胞的活化与应答,一方面阻止了CD28的活化,从而基因转录的水平上间接降低了IL2R表达和IL2等细胞因子的产生，影响了T细胞的效应过程. Nabeyama等［5］的异种胰岛移植实验也证明阻断共刺激分子通路在预防机体的细胞免疫反应中发挥着重要的作用，而预防体液免疫的功能不明显.

2.2诱导Th1/Th2型细胞的分化偏移B71, B72是B7家族的两个重要成员,它们介导的共刺激信号在诱导Th细胞的分化中起重要作用. B72介导的共刺激促使原始T细胞向Th2型方向分化并促进IL4的产生;B71介导的共刺激促使向Th1型的分化及IFNγ的产生. 实验表明CTLA4Ig主要作用位点是B72,应用于异体移植模型后可以引起Th1细胞减少,Th2细胞增多. Kita等［6］在LEW大鼠行同种心脏移植术后,立即经受体静脉注射腺病毒载体介导的CTLA4Ig基因,该处理显著延长移植心脏的存活期,在移植物周围持续表达IL4, IL10等Th2型细胞因子,而Th1型细胞因子如IL2, IFNγ等却几乎检测不到,推测CTLA4Ig抑制排斥反应的机制可能是下调Th 1型细胞因子,持续表达Th2型细胞因子所致.

2.3诱导树突状细胞介导的免疫耐受树突状细胞(dendritic cell, DC)作为功能最强的专职抗原提呈细胞,而且是初始型T细胞的惟一提呈细胞，在移植免疫中发挥关键作用. 因此,控制DC是诱导移植耐受的重要环节. CTLA4Ig可以通过抑制DC的活化、成熟过程,使其停留在未成熟阶段来诱导免疫耐受. CTLA4Ig也有可能是通过增加IL10, PGE2, 地塞米松，VEGF等抑制性因子的生成而诱导DC停留在未成熟阶段,从而诱导特异性的免疫耐受. CTLA4Ig阻断DC传递的共刺激信号则是近几年的研究热点. Lu等［7］研究认为,阻断成熟DC的共刺激通路是一个放大DC潜在耐受力的策略. 他们用CTLA4Ig重组腺病毒载体转染DC,使其表达CTLA4Ig基因. 经转染的DC可以显著抑制由未转染的DC产生的混合淋巴反应,而且B7分子的表达明显受到抑制，对T细胞只能诱导“克隆无能”. 贺伟峰等［8］通过逆转录病毒载体将人CTLA4Ig转染DCs,不但DCs表面CD86分子被CTLA4Ig有效的封闭,并且能够诱导抗原特异性T细胞的免疫耐受. Wang等［9］协同应用CTLA4Ig 和抗ICAM1抗体，以阻断共刺激通路，加强了未成熟树状突细胞诱导特异性免疫耐受的功能.

3CTLA4Ig预防异体移植排斥的实验研究

早在1992年,Lenschow等［10］即证实通过CTLA4Ig阻断B7/CD28共刺激通路能使大鼠异体心脏移植、异种胰岛移植物存活时间延长. 随后，应用CTLA4Ig在一系列实验中均显示其具有诱导免疫耐受的功能，能够延长移植物的存活时间. 在心、肝、肾、胰腺、小肠及复合组织移植方面均展示了良好的应用前景［11-14］.

Iwasaki等［15］把CTLA4Ig（0.5 mg/只）应用于一个鼠后肢肢体异体移植模型中，观察其在复合组织移植中的效果和不同时间给药的疗效，发现其在异体复合组织移植中也具有良好的预防免疫排斥的效果，通过存活时间和免疫组化显示，其最佳施药时间是移植后24~48 h，即最初的免疫反应开始的时刻为最佳施药时间. 当免疫排斥反应开始后再给药物，疗效不佳. 我们认为这可能是由于在 2 d时抗原提呈达到最高峰，这时给药可有效地阻断CD28/B7通路的结果，当抗原提呈发生后再给药，效果不佳.

Sho等［16］认为CTLA4Ig可以使移植物获得一定程度的耐受，混合应用免疫抑制剂可以减少免疫抑制剂的用量和其带来的副作用，并可以减少慢性排斥反应的发生. Ugurlu等［17］的实验显示CTLA4Ig和雷帕霉素协同应用于主要组织相容性复合体完全不相同的异体肺移植模型，移植物局部免疫组化显示CD8+T细胞的浸润减少，存活延长. 曹川等［12］利用吻合血管的同种异体大鼠耳廓移植模型观察局部外用CsA联合CTLA4Ig腹腔注射治疗对异体复合组织移植的免疫抑制及诱导免疫耐受的作用. 通过观察移植物的排斥反应、存活时间及检测移植后受体血清IL2含量变化. 发现两者协同应用显著延长移植物存活时间，且联合治疗组的受体血清IL2含量最低, 说明局部外用CsA联合CTLA4Ig能有效抑制异体复合组织移植排斥反应. 但是Watanabe等［ 18］在异种心脏移植模型中，其发现应用CTLA4Ig协同CsA进行治疗，并不能是异种心脏移植获得长期的存活和获得免疫耐受.

由于抗原提呈具有多条通路，单纯阻断CD28/B7通路不能完全阻断抗原提呈信号的传递. Yin等［19］混合应用CTLA4Ig 和抗CD40L抗体，同时阻断CD28/B7和CD40/CD40L通路，效果优于单用CTLA4Ig 或抗CD40L者，并且抑制了抗异体抗原抗体和抗Gal抗体的产生，显著延长了异体移植物的存活时间. Kosuge等［20］注射CTLA4Ig和ICOSIg，同时阻断可诱导的共刺激分子ICOS和CTLA4通路，不但显著的延长了异体心脏的存活时间，而且诱导了对特异性供体的耐受，可以接受特异供体的皮肤，而排斥特异供体以外的其它供体的皮肤. 另外移植物的血管内膜增生程度与应用他克莫司相比显著减少，还抑制了T细胞的增殖. 提示混合应用共刺激分子阻断剂在临床应用中具有良好的前景.

近年来利用基因工程的重组载体和基因转移技术，将CTLA4Ig基因转导入目的细胞，使其表达CTLA4Ig，促进异体模型发生耐受，也须取得了很大的进步. Reddy等［21］以腺病毒为载体将CTLA4Ig的cDNA转染移植到小鼠肝细胞，可将排斥期推迟50 d以上. Chen等［22］应用腺相关病毒载体把CTLA4Ig导入心肌细胞，而后移植入异体体内，显著的延长心脏的存活时间. Guillot等［23］也进行了相似的实验，用腺病毒介导CTLA4Ig转染移植的心肌,发现可以显著的延长移植物的存活时间，90%的移植物存活时间大于100 d,且移植1 a后还能在血浆中检测出CTLA4Ig;而用CTLA4Ig蛋白全身注射处理组,仅能延长移植物存活期22 d左右,代谢也较快，显示了基因治疗的良好效果. 但有实验表明，CTLA4Ig基因转到作用有器官特异性. Jooss等［24］发现CTLA4Ig转到入肝肺细胞内，能抑制肝及肺内T细胞的活化，但是肝脏中的转基因表达水平明显升高，而肺中转基因表达水平仅轻度增高. 很多实验也发现，同时应用可产生多种产物的基因或多种诱导方法综合应用，可进一步加强治疗效果，金永柱等［25］应用腺病毒介导CTLA4 FasL基因导入异体心脏内，试验中发现移植物局部同时分泌CTLA4和FasL，不但阻断了B7/CD28通路，而且促进了T细胞的凋亡，在鼠心脏异体移植模型中，显示了优于单一基因转到的效果. 张庆殷等［26］在鼠异体心脏移植术中注射供体脾细胞和CTLA4Ig腺病毒，然后再输注供体骨髓细胞，发现能够提高嵌合体水平，加深移植耐受，延长异基因大鼠心脏移植物存活.

4临床应用研究

目前临床应用方面的报道还很少，Guinan等［27］在1999年对12例接受骨髓移植的患者进行研究. 移植前收集受体外周血淋巴细胞作为抗原刺激细胞，与HLA不相合的供体骨髓共培养36 h，培养时加入CTLA4Ig，然后将处理过的供体细胞输入受体体内. 结果发现供体T细胞在对第三者抗原正常反应的情况下，对受体抗原的识别能力显著下降，即形成一种特异性的免疫耐受，12例中只有3例发生急性GVHD.

5CTLA4Ig诱导免疫耐受的局限性

首先B7/CD28只是T细胞活化中的一条辅助信号途径，同时它还可以通过其它途径活化，还存在除B7/CD28以外的其他共刺激通路，如CD40/CD40L途径、CD95（Fas）/FasL途径等，其在T细胞活化中的所占作用大小还需进一步探讨. 同时阻断该途径与其它辅助信号途径如CD40/CD40L等的作用显示了优于单纯阻断B7/CD28的效果，也显示了抗原提呈的多通路和复杂性. 另一方面，CTILA4Ig在阻断了T细胞B7/CD28辅助信号途径的同时，也同样阻断了B7/CTLA4负调信号途径. 目前的研究已经表明CTLA4在周围免疫耐受中起着关键的角色. Ariyan等［28］应用鼠胰腺移植模型，研究抗CD45RB作用的效果，实验表明应用抗CD45RB能上调CTLA4的表达，并增加异体抗原的耐受，延长其存活时间,说明B7/CTLA4在诱导免疫耐受方面也发挥着很强的作用. 因此找到一种特异性更强的分子，它仅阻断B7/CD28途径，而对B7/CTLA4途径影响不明显，甚至能促进B7/CTLA4负调信号，则将会取得更好的治疗效果.

另外，尽管CTLA4Ig的加入可以延长移植物的存活时间,但这种耐受并非是长期稳定的，它可以被DC提呈抗原或IL2等细胞因子的存在所逆转,最终移植物均被排斥. 一方面是其它辅助信号通路的结果，另一方面记忆性T细胞也发挥着重要的作用. 成熟的T细胞一部分分化为效应性T细胞,一部分分化为记忆性T细胞,记忆性T细胞的激活并不依赖共刺激信号, 在多数情况下，免疫耐受状态的逆转可能与记忆性T细胞激活有关，所以CTLA4Ig对其作用似乎有限. 虽然基因治疗较单纯输入CTLA4Ig可以获得更长时间的耐受，但是现有基因导入方法的效率及潜在的不良反应，也限制了其广泛应用.

总之，通过以上文献可以看出应用CTLA4Ig阻断B7/CD28共刺激通路可以诱导抗原特异性的免疫耐受，并在各种实验中显示了良好的效果. 虽然目前由于其还存在各种各样的局限性，但是就其特异、低毒、高效的特点而言,经过进一步的努力，预期在诱导异体移植方面将会有很大的发展前景.

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