酶联免疫吸附法检测饲料中赭曲霉毒素A

摘要：将赭曲霉毒素A进行化学修饰，制备赭曲霉毒素A半抗原及人工抗原，免疫动物，并通过单克隆抗体技术制备了赭曲霉毒素A的单克隆抗体及酶标记抗体，建立赭曲霉毒素A的酶联免疫吸附法。结果表明，该法灵敏度为1 μg/L，在20 μg/kg和40 μg/kg的加标水平下，赭曲霉毒素A在饲料（浓缩料、配合料和原料）的回收率为81.8%～96.1%，变异系数为8.3%～12.2%。本法适用于饲料样本中赭曲霉毒素A的检测。

关键词：酶联免疫吸附法；单克隆抗体；赭曲霉毒素A；饲料

中图分类号：S816.32 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）14-3406-03

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）是一种真菌毒素，主要由产毒曲霉菌和青霉菌产生，常污染食品和饲料[1，2]。赭曲霉毒素A能引起动物急性和慢性中毒，是强致癌物，对肾脏造成不可逆的致死毒害，还可导致胎儿畸形、流产甚至死亡，其对人类的潜在危害备受关注[3，4]。国际癌症研究机构在1993年将其定为人类可能致癌物，赭曲霉毒素A广泛存在于农产品及畜产品中，通过污染食物和饲料直接或间接进入人类食物链，因此有必要加强对赭曲霉毒素A的检测[5，6]。

目前，赭曲霉毒素A的残留分析方法主要有免疫学检测方法和仪器分析方法，仪器检测方法主要通过其荧光特性进行高灵敏度检测，其样本处理过程一般较复杂，检测成本较高；免疫分析法是以抗原抗体免疫化学反应为基础进行测定的方法，具有灵敏度高、快速简便等优点[7，8]。本试验建立了基于单克隆抗体的ELISA法检测赭曲霉毒素A，其灵敏度高、快速简便，适用于饲料中赭曲霉毒素A的快速批量检测。

1 材料与方法

1.1 样品与主要试剂

饲料（浓缩料、配合料、原料）样品购于贵阳某农贸市场，均质后置于4 ℃，待测。

赭曲霉毒素A标准品，购自中国兽医药品监察所；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、辣根过氧化物酶（HRP），购自Sigma公司；其他常规试剂，除特别注明外均购自北京化学试剂公司。

1.2 主要仪器

MK3酶标仪（美国热电雷勃仪器有限公司）；96孔酶标板（美国Costar公司）；TDL-40B离心机（上海安亭）。

1.3 试验动物

8周龄雌性BalB/C小鼠，由北京勤邦生物技术有限公司提供并饲养。

1.4 方法

1.4.1 赭曲霉毒素A半抗原的合成 将赭曲霉毒素A与1， 3-丙二胺反应得到赭曲霉毒素A半抗原。具体步骤如下：取20 mg赭曲霉毒素A，10 μL 1，3-丙二胺，催化量的4-二甲氨基吡啶溶解于2 mL N， N’-二甲基甲酰胺中，得到Ⅰ液；取20 mg N，N’-二环己基碳二亚胺溶解于0.5 mL DMF中，得到Ⅱ液；在0 ℃条件下，将Ⅱ液缓慢滴加至Ⅰ液中，恢复至室温后，继续反应20 h；蒸除溶剂并柱层析（洗脱液：二氯甲烷/甲醇，体积比20∶1），得到赭曲霉毒素A半抗原。具体合成技术路线如图1。

1.4.2 赭曲霉毒素A免疫原及包被原的合成 将赭曲霉毒素A半抗原分别与牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）偶联，得到赭曲霉毒素A免疫原与包被原。免疫原合成过程：取赭曲霉毒素A半抗原5.3 mg用0.5 mL DMF溶解，得到Ⅰ液；取BSA 30 mg，以2.0 mL，pH 7.0，0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液溶解，得到Ⅱ液；取碳化二亚胺（EDC）10 mg，以0.5 mL，pH 7.0，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液溶解，得到Ⅲ液；将Ⅰ液与Ⅱ液混合，在搅拌下缓慢滴加入Ⅲ液，室温反应2 h，4 ℃透析3 d，每天换液3次，得免疫原。包被原合成将载体蛋白换成OVA，制备过程参照免疫原制备过程。

1.4.3 动物免疫及单克隆抗体的制备 用150 μg的赭曲霉毒素A免疫原与等量完全福氏佐剂（FCA）混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射。二免和三免时，将FCA换成非完全福氏佐剂（FIA），剂量方法同上，每次免疫间隔时间为2周，三免后第7天，小鼠尾静脉采血，室温静置1 h，4 ℃过夜，12 000 r/min离心10 min，收集血清，4 ℃保存，用间接ELISA法测定血清效价，待效价较高时，按照150 μg/只腹腔加强免疫。3 d后取小鼠脾脏进行细胞融合，以有限稀释法筛选阳性克隆，并按照常规方法制备腹水抗体，用饱和硫酸铵法纯化后备用。

1.4.4 酶结合物的制备 采用过碘酸钠法[9]制备抗体与辣根过氧化物酶（HRP）的酶标记抗体。

1.4.5 包被 通过测定抗体效价，确定抗原、抗体的工作浓度，以此为基础对酶标板的包被工艺及各个环节的工作温度、缓冲液体系进行优化[10，11]。制备检测赭曲霉毒素A的酶标板，用包被缓冲液将包被原稀释成0.1～0.2 μg/mL，每孔加入100 μL，37 ℃温育2 h，倾去包被液，用洗涤液洗涤2次，每次30 s，拍干，然后在每孔中加入150～200 μL封闭液，37 ℃温育1～2 h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存，待用。

1.4.6 样品分析 向包被有赭曲霉毒素A偶联抗原的酶标板微孔中加入赭曲霉毒素A标准品溶液或饲料样品提取液20 μL，再加入酶结合物工作液100 μL，用盖板模封板，25 ℃避光反应10 min，倒出孔内液体，每孔加入250 μL磷酸盐缓冲液充分洗涤4～5次，每次间隔10 s，于吸水纸上拍干，每孔加入底物液A过氧化脲50 μL，底物液B四甲基联苯胺（TMB）50 μL，轻轻振荡混匀，25 ℃恒温箱避光显色5 min，每孔加入2 mol/L终止液硫酸50 μL，轻轻振荡混匀，于450 nm下测定每孔吸光度值。

1.4.7 标准抑制曲线的制备 以不同浓度的赭曲霉毒素A标准液的吸光度平均值（B）除以空白溶液的吸光度值（B0）再乘以100%，得到竞争抑制率，以赭曲霉毒素A标准品浓度（μg/L）的对数值（lgC）为X轴，竞争抑制率为Y轴，绘制标准曲线。

1.4.8 前处理 称取5.0±0.05 g样品至50 mL聚苯乙烯离心管中，加入25 mL 50%（V/V）甲醇，振荡5 min，3 000 r/min离心5 min；取500 μL上清液于2 mL聚苯乙烯离心管中，加入500 μL 10%（m/V）氯化钠水溶液，振荡1 min，混匀；取20 μL分析。

1.4.9 最低检测限、回收率及精密度 取20份空白样品，按照上述步骤分析，通过标准曲线计算对应浓度。以20份空白样品提取液的吸光值平均值加上3倍标准差作为样本检测的最低检测限[12]；另取赭曲霉毒素A标准品分别对饲料样品按照20、40 μg/kg添加水平，进行回收试验，每个浓度做4个平行，计算准确度及精密度。

2 结果与分析

2.1 标准抑制曲线

从标准抑制曲线（表1、图2）可得出，本方法检测灵敏度为1 μg/L，赭曲霉毒素A单克隆抗体对赭曲霉毒素A的IC50值为5.3 μg/L。

2.2 最低检测限

对空白饲料（浓缩料、配合料、原料）样本平行测定20次，结果见表2。测定结果的平均值加上3倍标准差为试剂盒实际样本的最低检测限，结果表明本方法对浓缩料、配合料、原料的检测限分别为9.3、9.0、8.2 μg/kg。

2.3 准确度与精密度

ELISA法的准确度以回收率表示，精密度以变异系数表示。取饲料样本（浓缩料、配合料、原料）添加赭曲霉毒素A标准品至20、40 μg/kg，分别对样本进行添加回收试验，每个浓度设4个平行，分别计算回收率与变异系数，结果见表3。

由表3可知，含20 μg/kg赭曲霉毒素A的浓缩料、配合料和原料的添加回收率为81.8%～94.5%，变异系数为10.3%～12.2%；含40 μg/kg赭曲霉毒素A的浓缩料、配合料和原料的添加回收率为84.8%～96.1%，变异系数为8.3%～10.9%。本试验结果符合农医发[2005]17号农业部文件《兽药残留检测试剂（盒）备案参考评判标准》，处于可接受范围。

3 结论

本试验制备了赭曲霉毒素A单克隆抗体，初步建立了赭曲霉毒素A酶联免疫试剂盒检测方法。结果表明，本方法的灵敏度为1 μg/L，对浓缩料、配合料和原料的检测限分别为9.3、9.0和8.2 μg/kg，分别添加20、40 μg/kg水平赭曲霉毒素A，饲料（浓缩料、配合料和原料）的添加回收率为81.8%～96.1%，变异系数为8.3%～12.2%。运用酶联免疫方法对饲料中赭曲霉毒素A残留量进行筛选，样本前处理简单，仪器设备投资少，检测成本低，所需检测时间短，本方法适用于饲料样本中赭曲霉毒素A的初筛。

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