酶联免疫吸附法测定黄曲霉毒素B1探讨

【摘要】本文对酶联免疫吸附法（ELISA）测定花生油中的B1进行探究分析，总结酶联免疫吸附法（ELISA）的方法与其他常用测定发进行比较探讨，并对酶联免疫吸附法测定黄曲霉毒素B1的方法进行了简单的阐述。

【关键词】酶联免疫吸附法 测定 黄曲霉毒素B1

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉两者产生的次生代谢产物，其中最主要的是黄曲霉毒素B1，其主要存在于霉变的谷物、大米、果仁和花生等食物中，在食用油等制品中也常常能够发现黄曲霉毒素B1。目前常用的方法主要有薄层层析法（TLC）、液相色谱法（HPLC）和酶联免疫吸附法（ELISA）[1]。用HPLC虽然有着特异性好，灵敏度高和测定结果准确可靠这些优点，但是其技术要求高，仪器昂贵，不易于普遍使用。而TLC方法的样品处理过程比较繁锁，而且分析时间长，操作人员要直接接触毒素和大量有机溶剂，不适宜大批量样品的快速检测，主要是用来做半定量。因此，本文用酶联免疫吸附法测定黄曲霉毒素B1，并对酶联免疫吸附方法进行了探讨和分析。

一、酶联免疫吸附法

免疫分析技术在黄曲霉毒素分析过程中是最为引人注目的，因为它们具有高度的灵敏度和选择性，而且具有快速和大批量检测的能力。竞争性酶联免疫吸附试验（ELISA）从1995年起已成为AOAC检测黄曲霉毒素的官方方法。ELIAS根据具体操作的不同还可分为直接法和间接法。

（一）直接方法

操作程序如下：（1）包被：每孔加100μL适当稀释度的包被抗原B1-BSA（黄曲霉毒素一牛血清白蛋白），于37℃放置3h。（2）洗涤：用0.0lmol/L的PBST（磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液，PH为7.4）洗涤3次，所制备的微孔ELISA板放置于4℃下备用，保存期6个月。（3）加样：每孔先加AFB1标准或样品提取液50μL，再加适当稀释度的B1抗体-HRP复合物（B1抗体-辣根过氧化物酶）50μL，于适当温度反应一定时间，再按上述方法洗涤。（4）显色：每孔加反应底物溶液100μL，于适当温度反应一定时间。（5）终止反应：每孔加一定浓度的硫酸溶液。最后放入酶标仪中检测。Joanna Leszczynska等人采用此法检测了奶酪和酸奶酪中黄曲霉毒素B1和M1以及黄曲霉毒素总量。

（二）间接方法

原理：将固相B1复合抗原预先包被在酶标板上，使用时加入抗B1抗体和样品提取液，使固相抗原与样品提取液中的B1竞争性地与B1抗体结合，然后加入酶标II抗，经充分反应后加入显色液，所显颜色的深浅与样品提取液中B1含量成反比。

操作程序：包被：每孔加100 μL适当稀释度的包被抗原 B1-BSA，于37℃放置3h或4℃放置过夜；洗涤：用0.0lmol/PBST（PH为7.4）洗涤3次，（致敏的微孔ELISA板可于4℃千燥保存6个月备用）；加样：每孔先加50μL系列稀释的标准溶液或样品提取液，再加50μL适当稀释度的抗体，于37℃反应1h。洗涤方法如上；二抗：每孔加100μL羊抗兔-HRP结合物（1：4000），37℃反应1h。洗涤方法同上；显色：每孔加100μL底物溶液，37℃反应10min；终止反应：每孔加一定量一定浓度的硫酸溶液，终止反应。立即放入酶标仪中测定吸收值。

二、几种测定方法差异

酶联免疫法的影响因素主要有：pH值、脂肪、重金属等，金属离子的存在严重破坏了酶的活性，致使酶底物加入后显色偏浅，易出现假阳性；脂肪吸附在包被抗体孔中，阻碍了样品液（抗原）与特异性抗体的结合，同样容易造成假阳性。

赵晓联等就提取溶剂的组成、酸碱性、含盐量以及金属离子的含量对ELISA检测结果的影响进行了考察。提取溶剂随着甲醇含量的增大，样品提取液偏向假阳性的趋势就越大，当甲醇含量10～40%时，其对测定的影响可以忽略；当甲醇含量超过50%时，表现为假阴性增强。而待测样品的pH值对测定结果影响很大，当pH值小于4时，结果显示为假阳性；当pH值高于8时，结果偏为假阴性，因此应将待测样品液的pH值调至6～7再进行测定。盐浓度与ELISA测定结果的关系是：随着盐浓度的增大，测得结果有偏向假阳性的趋势，但变化比较平稳，用三氯甲烷对盐溶液进行提取后，可基本消除盐对ELISA测定结果的影响。当Fe3+浓度超过0.lmg/mL时，对酶的影响显著增强，Fe3+浓度在.02mg/mL时，测定结果呈假阳性，因此，最终待测样品提取液中的Fe3+含量不应超过0.lmg/mL。Cu2+浓度小于1.0mg/mL时，它对ELISA测定的影响在可接受的范围之内。用三氯甲烷提取以后，Fe3+和Cu2+对测定结果的影响都在可接受范围之内。

宓晓黎对食品和饲料中的黄曲霉毒素检测做了ELISA方法学论证实验，其实验最低检出限为2.5pg；板内重复性实验不同水平的平均相对标准偏差为7.8%；三个不同水平的回收率实验为89～95%。他们利用自己人工合成的B1抗原和酶标B1抗原，又制备了人工抗体，其活性和效价高，整个检测只需1.5h，降低成本将近30倍。

ELISA实验一般操作不当容易出现假阳性，所以在做方法学论证时一般需HPLC方法对其实验结果进行佐证。Ramon Asis对杏仁等食品检测结果表明，ELISA和HPLC的检测结果相关性相当好，其相关系数为0.9777，两种方法具有高度的一致性（P

目前，黄曲霉毒素也常常通过反相液相色谱-荧光检测器来进行检测，但黄曲霉毒素B1在水相溶剂中容易发生荧光淬灭，高效液相色谱（HPLC）和酶联免疫吸附检测（ELISA）在分析食品中的黄曲霉毒素时运用得比较多，例如花生、花生酱以及玉米[3]。ELISA方法能达到筛选的目的（阳性或阴性），由于其灵敏度比较高，可在实验室中做最低检测限量研究用，但相对来说，ELISA的可靠性相对较差。

三、讨论

总体来说，利用酶联免疫吸附法（ELISA） 测定黄曲霉毒素B1，不但样品处理简单，检测也较为快速方便，重复性良好，而且特异性高，十分适合基层检测机构大批量样品的初筛检测。

参考文献：

[1]江湖，熊勇华，许杨.黄曲霉毒素分析方法研究进展[J].卫生研究，2005，（2）.

[2]贾玉珠，骆和东，林健，等.HPLC 法同时检测食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1 和 G2 的研究[J].海峡预防医学杂志，2005，（3）.

[3]王海花，汪德刚，张晓峰.黄曲霉毒素检测技术的研究进展[J].食品研究与开发，2006，（4）.