沙眼衣原体感染对凋亡的影响

摘要：目的：通过探讨沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，CT）感染对凋亡的影响，为研究男性不育提供新思路。方法：1.沙眼衣原体的检测：免疫层析法2.凋亡的检测：常规细胞形态学染色（瑞-姬染色）、末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的脱氧核苷酸原位末端标记法（TUNEL）结果：CT阳性组凋亡率33.03±14.98%，正常对照组凋亡率为9.68±2.78%，组间差异显著（P

关键词：男性不育沙眼衣原体凋亡

中图分类号：R-331文献标识码：A文章编号：（2013）03-0026-04

To Study about the effect of the chlamydia trachomatisTo Study about the effect of the chlamydia trachomatis infection on Sperm apoptosiss

ZHENG Li-hong（GuiYang Nursing Vocational College，Guiyang 550003，Guizhou）

Abstractt：Objective：To provide new ideas and develop new vision for clinical research and treatment about male infertility by explorating on the effect of CT infection on sperm apoptosis . Method：1. Detection of Chlamydia trachomatis：immunochromatography 2. Apoptosis Detection：Terminal deoxynucleotidyl transferase enzyme （TdT）-Road deoxynucleotidyl in situ end labeling （TUNEL）. Results：Sperm apoptosis rates were 33.03±14.98%and 9.68±2.78% in CT infection group and normal fertility group respectively； There was dramatically difference between two groups （P

Key wordss：male infertility； Sperm Chlamydia trachomatis ； apoptosis

的产生、成熟及输送是个复杂的过程，任何一个环节的异常对受精均有影响，最终影响男性的生育力。男性生殖道的感染是引起男性不育一个非常重要的因素。在症状和非症状男性生殖道感染中，起关键作用的两种生物体是解脲支原体（mycoplasma urealytium；MU）和沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis；CT）。近年来，关于解脲支原体感染与男性不育的关系已有大量的报道，但沙眼衣原体感染对及男性不育有何影响见诸报道不多[1-3]，CT感染引起男性不育的机制仍不清楚。据WHO报道每年全球约5亿人新发性传播疾病，其中的18%是由CT感染造成[4，5]。在女性中，年轻、性活跃者是生殖道CT感染的好发人群，作为感染的“核心”人群，对CT的传播起着重要作用；在男性中，泌尿生殖道CT感染率不易确定，其原因是CT感染不易作微生物学检查或为无症状者。细胞凋亡（apoptosis）是细胞在胞外或胞内信号诱导下发生的主动自杀死亡过程，是调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程。关于凋亡与男性不育的关系已有报道[6]。因此，本课题为明确沙眼衣原体感染引起男性不育的机制，于2012-2013年进行了沙眼衣原体感染对凋亡的影响进行了有益探索。

1材料与方法

1.1研究对象

正常对照组15例，有正常生育史，身体健康，沙眼衣原体检测阴性。常规正常的自愿捐者，年龄24-32岁，平均年龄27.73±2.20岁。

CT阳性组57例，来自于我院不育门诊，为婚后同居2年以上，有正常性生活，未采用任何避孕措施，、附睾、内分泌、染色体等检查无异常；沙眼衣原体检测阳性，年龄24-40岁，平均年龄28.81±3.31岁，不育年限2-10年，平均4.37±2.70年，其配偶检查无异常。

1.2试剂

TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒由南京凯基生物技术有限公司提供。沙眼衣原体（CT）快速免疫检测试剂盒由英国Unipath公司提供。1×Earle’s和10×Earle’s液由Sigma公司提供。percoll原液由南京凯基生物技术有限公司提供。TritonX-100由北京拜尔迪生物公司提供。

1.3研究方法

所有研究对象均禁欲3-5天，法收集全程于无菌玻璃容器中，置于35℃恒温恒湿箱中待其液化。取液化后的2ml加入底部有2ml45% Percoll液的离心管中，2000r/min，离心10min，细胞主要沉积于精浆和45%Percoll液之间，于精浆与45%Percoll液之间用移液器取50ul×5次沉淀入另一组离心管中，加入2ml生理盐水，充分混匀，1500r/min，离心10min，弃上清，加入生理盐水2ml，充分混匀后，1500r/min，离心10min，弃上清，加入生理盐水2ml，充分混匀后，1500r/min，离心10min，弃上清，加入3min生理盐水，充分混匀，配成一定浓度的细胞悬液。取制备好的细胞悬液50ul滴加多聚赖氨酸放脱玻片（TUNEL时用）上，用采血针推平，弃去多余的细胞悬液，平放在干净的桌面上，自然凉干。

1.4沙眼衣原体检测

严格按照试剂盒说明书进行操作，方法为免疫层析法。

1.5TdT介导的TUNEL法检测凋亡

取已制备好的多聚赖氨酸放脱玻片细胞样本浸入固定液，室温（15-25℃）固定15-30min-1h；-20℃的乙醇中放置2h；PBS漂洗3次，每次5min（下同）；浸入封闭液，室温（15-25℃）封闭10min；PBS漂洗3次，每次5min；浸入通透液中，冰上（2-8℃）促渗2min。PBS漂洗两次，样本周围用吸水纸吸干；每个样本滴加50ulTdT酶反应液，加盖玻片37℃避光湿润反应60min；PBS漂洗3次，样本周围用吸水纸吸干；滴加50ul Streptavidin-HRP-工作液，加盖玻片37℃湿润避光反应30min；PBS漂洗3次；滴加50ul DAB工作液，室温显色反应10min；PBS漂洗3次，光学显微镜下检测及拍照。

1.6统计学处理采用SPSS12.0统计软件包进行χ2检验。结果用x（_）±s表示。

2结果

2.1正常对照组15例，CT阳性组共57例，每例随机观察头尾部，计数凋亡，统计凋亡率（计数500个，计算凋亡数占总数的比例），其中正常对照组凋亡率为9.68±2.78%；CT阳性组凋亡率达到33.03±14.98%。

2.2TdT介导的TUNEL法检查凋亡

TdT介导的TUNEL法是检测凋亡细胞的常用方法。本课题运用TdT介导的TUNEL法对正常对照组和CT阳性组标本进行处理后，随机观察正常对照组和CT阳性组标本，凋亡头部呈棕黄色（图1、图2），而未凋亡未着色。

3讨论

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，CT）是一类专性细胞内生长、有独特发育周期的原核细胞型微生物，很少从正常男性尿道中分离出来，但被认为是非淋菌性尿道炎（NGH）、附睾炎和慢性前列腺炎的主要病因之一，因此其对男性生育的影响引起了人们的关注。本课题研究结果显示CT阳性组和正常对照组凋亡率分别为33.03±14.98%和9.68±2.78%，组间差异显著（P

细胞凋亡（apoptosis）是多细胞生物普遍存在的细胞死亡形式之一；有研究显示：在生长发育、组织代谢和一些疾病等许多生理和病理过程中，凋亡都发挥着极为重要的作用。目前检测凋亡的方法很多，其中原位末端标记技术—TUNEL法是分子生物学与形态学相结合的研究方法，可对完整的单个凋亡细胞或凋亡小体进行原位染色，能准确反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征。DNA裂解为许多单或寡核苷酸片断是细胞凋亡的主要生化标志。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，很少能够被染色〔11〕。本课题应用TdT介导的TUNEL法检测正常对照组和CT阳性组标本，结果发现凋亡呈棕黄色，而未凋亡不着色。

综上所述，本课题研究表明CT感染导致了凋亡率增加，进一步证实了沙眼衣原体（CT）感染是导致男性不育的重要原因之一。

参考文献

〔1〕郭应禄，胡礼泉主编.男科学（M）.北京，人民卫生出版社，2004，410～969.

〔2〕Idahb A，Boman J，Kumlin U，et al.Demonstration of Chlamydia trachomatis IgG antitldies in the male partner of the infertile couple is correlated with a reduce likelihood of achieving pregnancy〔J〕. Hum Reprod，2004，19（5）：1121～1126.

〔3〕Eley A，Pacey A A，Galdiero M，et al.Can Chlamydia trachomatis directly damage your sperm？〔J〕. Lancet Infect Dis，2005，5（1）：53～57.

〔4〕Nyari T，Nyari C，Woodward M，et al.Screening for Chlamydial trachomatis in asymptomatic women in Hungary.An epidemiological and cost-effective analysis. Acta Lbstet Gynecol Scand〔J〕.2004，80（4）：300～306.

〔5〕Schillinger J A.Dunne E F，Chapin J B，et al. Prevalence of Chlamydia trachonmatis infection among men screened in 4 U.S.Cities（J）.Sex Transm Dis，2005，32（2）：74～77.

〔6〕付松克罗米芬对特发性少精症生精细胞凋亡的影响〔J〕.中国综合临床.2006，19（11）：1039～1040.

〔7〕李伟毅等。溶脲脲原体对小鼠巨噬细胞产生TNF-α的影响〔J〕。生殖与避孕，1996（1）：54～55.

〔8〕Dousset B，Hussenet F.Cytokines in the human seman.A new approach tomale fertility.Presse〔J〕Med，1997（1）：24.

〔9〕Darville T，Andrews CW，Laffoon KK，et al. Mouse strain dependent variation in the course and outcomeofChlamydiagenitaltractinfectionis associated with differences in host response〔J〕.Infect Immum，2005，65（8）：2024～2056.

〔10〕Spadafora C.Sperm cells and foreign DNA：a controversial relation〔J〕.Bioessays，2003，19（15）：955～964.

〔11〕Witkin SS.Immunolonical aspects of genital Chlamydia infenctions.Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol，2002（6）：865～874.