17β

作者：韦耿泽，朱运龙，胡玉珍，周京军

【关键词】 ,雌二醇

βestradiol suppresses expression of κOR gene in CNE2 cell line

【Abstract】 AIM: To observe the regulatory effect of 17βestradiol on the expression of kappa opioid receptor (κOR) mRNA and protein. METHODS: Semiquantitative RTPCR and Western blot were used to analyze the mRNA content and protein expression in CNE2 cells 24-72 h after treated with 17 βestradiol. RESULTS: Compared with that in control group, κOR mRNA reduced to (49.2±7.66)% (P<0.01) and (20.8±7.71)% (P<0.01) respectively, after 1 μmol/L 17βestradiol treatment for 24 and 72 h. The quantity of protein decreased to (60.8±8.36)%, (32.9±7.13)% and (29.8±8.41)% (P<0.01) respectively following 1 μmol/L 17 βestradiol treatment for 24, 48 and 72 h. CONCLUSION: Estrogen can inhibit the transcription of κOR in CNE2 cells.

【Keywords】 estradiol; receptors, opioid, kappa; CNE2 cells

【摘要】 目的： 观察雌激素对κ阿片肽受体（κOR）mRNA含量和蛋白表达的调节作用. 方法： 采用半定量RTPCR和Western blot方法，检测17β雌二醇作用24～72 h后CNE2细胞κOR mRNA含量和蛋白表达的变化. 结果： 17β雌二醇(1 μmol/L)作用24 h后，CNE2细胞表达κOR mRNA和蛋白明显降低，mRNA和蛋白含量分别下降到对照组的(49.2±7.66)% （P<0.01）和(60.8±8.36)%（P<0.01）；作用时间延长到48 h后，CNE2细胞κOR蛋白含量为对照组的(32.9±7.13)% （P<0.01）；而延长到72 h后，κOR mRNA和蛋白含量分别下降到对照组的(20.8±7.71)% （P<0.01）和(29.8±8.41)% （P<0.01）. 结论： 雌激素能够从转录水平抑制κOR在CNE2细胞的表达.

【关键词】 雌二醇；受体，阿片样，κ；CNE2细胞

0引言

女性药物成瘾患者越来越多. 研究发现，女性从接触阿片肽到成瘾需要的时间比男性更短. 应用动物自我给药实验，雌性大鼠比雄性大鼠更容易发展成主动寻药行为［1］. 而行卵巢切除术的雌性大鼠，阿片肽类物质自我给药行为比未进行手术的雌性大鼠明显降低，当给予雌激素替代后，这种自我给药行为显著增强［2-3］. Maggi等［4］曾报道雌激素能够调节阿片肽受体的数量，但并未阐明其机制，有学者发现雌激素能够引起阿片肽受体内向化（从细胞膜转移到细胞质内），这部分地解释了雌激素为什么可以减少细胞膜阿片肽受体. 我们观察在人未分化鼻咽癌CNE2细胞中雌激素是否可以调节κ阿片肽受体（kappa opioid receptor, κOR) mRNA和蛋白的表达.

1材料和方法

1.1材料

细胞培养用DMEM培养基、RPMI1640培养基、胰酶与EDTA、抗生素以及胎牛血清（Invitrogen公司）；PCR和Western blot实验用缓冲液、反转录酶、Taq DNA聚合酶（Promega公司）；RNA提取液TRIZOL（Invitrogen公司）；水溶性17β雌二醇（Sigma公司）；细胞培养用设备和耗材（Invitrogen公司，Nunc公司）；其他实验用试剂和药品均购自Sigma公司. CNE2细胞(人未分化鼻咽癌，已证实此细胞系能够表达有功能活性的κOR蛋白［5］)由香港大学的Fong教授馈赠.

1.2方法

1.2.1细胞培养将1×105个CNE2细胞接种于60 mm培养皿中，培养16 h后换为去除类固醇的RPMI1640培养液（无酚红），加入10 mL/L FBS, 1×105 U/L青霉素、100 g/L链霉素. 在37℃, 50 mL/L CO2孵箱中培养24 h后加入终浓度为1 μmol/L 17β雌二醇，再继续培养24, 48, 72 h后收获细胞提取总RNA和蛋白质.

1.2.2Western blot在6孔培养板中培养CNE2细胞，加入1 μmol/L 17β雌二醇分别作用24, 48, 72 h后，PBS清洗3次，加入裂解缓冲液35 μL ［Hepes 20 mmol/L, MgCl2 2.5 mmol/L, EDTA 0.1 mmol/L, βglycerophosphate 20 mmol/L, dithiothreitol (DTT) 0.5 mmol/L, sodium orthovanadate 0.1 mmol/L, NaCl 75 mmol/L, leupeptin 4 mg/L, phenymethylsulfonyl fluoride(PMSF) 20 mg/L, Triton X100 0.5 mL/L］，细胞刮刀刮下细胞及裂解物，收集到离心管内，超声破碎后低温高速离心收集上清液，用Bradford法进行蛋白定量. 样本经95℃ 10 min后，加样到制备好的SDSPAGE加样孔中，电泳3~6 h后转到尼龙膜，用相应的一抗和二抗孵育，ECL显色，置暗室中使胶片曝光及显像，用imagetool图像分析软件读取电泳条带灰度值.

1.2.3半定量RTPCR实验分为3组： 对照组（未加药组）、实验A组（1 μmol/L 17 β雌二醇作用24 h）和实验B组（1 μmol/L 17 β雌二醇作用72 h），每组重复6次. 引物设计： 在GenBank中获得所需构建的人κOR基因的cDNA序列，应用引物设计软件primer3设计所扩增基因的引物. 引物序列： κOR，上游引物5′ccgatacacaaagatgaagac3′，下游引物5′gtgcctccaaggactattgc3′；GAPDH，上游引物 5′ctcagacaccatggggaaggtga3′，下游引物 5′atgatcttgaggctgttgtcata3′. RNA提取和纯化：总RNA的提取按照Trizol试剂操作指南进行. 反转录体系为：5×RT缓冲液5 μL；25 mmol/L dNTP 1 μL； 100 mg/L随机引物2 μL； 4×107 U/L RNA酶抑制物0.5 μL；反转录酶0.7 μL；总RNA样本2 μg； DEPC水补充到25 μL，充分混匀，42℃温育1~2 h， 95℃处理5 min灭活反转录酶. PCR反应采用GAPDH为内对照，反应体系为： cDNA 1 μL；25 mmol/L dNTP 0.4 μL；10×PCR缓冲液2.5 μL；15 pmol/L上游引物0.5 μL；15 pmol/L下游引物0.5 μL；Taq DNA聚合酶0.5 μL；双蒸水补充到总体积为25 μL. 扩增条件为95℃解链5 min，然后进入以下25个循环： 95℃解链1 min， 60℃退火1 min， 72℃延伸1 min；最后72℃延长10 min. 反应产物进行DNA凝胶电泳，紫外成像后用imagetool图像分析软件读取电泳条带灰度值并将所检测基因强度（灰度值）与内对照基因强度（灰度值）的比值进行统计学分析.

统计学处理： 实验数据以x±s表示，用SPSS统计软件，各实验组与对照组的比较采用t检验，以P<0.05为有显著性差异.

2结果

2.1雌激素对κOR蛋白表达的作用与对照组相比，1 μmol/L 17β雌二醇作用CNE2细胞24 h后κOR的蛋白含量明显降低，为对照组的(60.8±8.4)% （n=6, P<0.01）（对照组为100%），而在作用48, 72 h后，κOR的蛋白含量分别降到对照组的(32.9±7.1)%和(29.8±8.4)% （n=6, P<0.01，图1）.

2.2雌激素对(OR mRNA表达的影响与对照组相比，1 μmol/L 17β雌二醇作用CNE2细胞24 h后κOR的mRNA水平明显降低，为对照组的(49.2±7.7)% （n=6, P<0.01），而1 μmol/L 17 β雌二醇作用72 h后，κOR的mRNA水平降到对照组的(20.8±7.7) % （n=6, P<0.01，图2）.

3讨论

我们的实验结果发现17β雌二醇（1 μmol/L）在作用24~72 h后CNE2细胞内κOR mRNA和蛋白水平均较未加药组明显减少且具有时间依赖性，从而提示雌激素能够在转录水平调控κOR的表达.

雌激素是机体内重要的类固醇激素，在机体的生长发育和代谢等方面起重要作用. 随着对药物成瘾和镇痛的研究，人们发现雌激素对内源性阿片肽类物质及其受体的合成和分解可能具有调节作用. Stoffel等［7］人发现大鼠卵巢切除术后，给予雌二醇可以明显减弱吗啡对疼痛的抑制作用，说明雌激素能够影响阿片肽类物质的作用. 最近研究［7］发现中枢给予雌激素后可增加大鼠的疼痛，而雌激素受体拮抗剂ICI 182, 780能够阻断这种作用. 另外，在出生前给予吗啡可改变成年雌性大鼠海马MOR（μ型阿片肽受体）的密度［8］. 而Maggi等［4］曾报道大鼠下丘脑MOR的数量随其动情周期而变化，随后应用受体结合实验观察大鼠卵巢切除对下丘脑MOR的变化，他们发现与对照组比较，卵巢切除术后3d大鼠下丘脑的MOR有减少趋势，而术后21 d明显减少. 然而其他学者采用放射自显影技术显示卵巢切除术的大鼠海马比未进行手术的大鼠海马区纳络酮结合位点密度明显增加，给予雌激素可明显减少纳络酮结合位点的密度. 有学者将雌激素受体转染到成神经细胞瘤细胞系（此细胞系可以表达MOR和DOR），构建成稳定表达雌激素受体的细胞系（SKER3），加入雌激素16 h，受体结合实验显示MOR和DOR没有改变，但是当雌激素作用16 h后换成无雌激素的培养液继续培养6 d，受体结合实验显示MOR数量减少，ICI182780能够拮抗雌激素对MOR的下调作用［4］. 然而以上结果并没有解释细胞膜表面受体数量减少是合成抑制还是降解增加所致. 有人采用激光共聚焦显微镜发现在海马区和边缘系统雌激素可以使MOR从细胞膜转移至细胞质（内向化），由此推测可能是由于雌激素可以促进阿片肽受体内向化而使受体在细胞表面的数量减少，因此也初步解释了受体结合实验显示的雌激素使细胞膜阿片肽受体数量减少的原因；而加入阿片肽受体拮抗剂纳曲酮能够抑制雌激素诱导的MOR内向化，提示雌激素可能通过促进内源性阿片肽的分泌，进而引起其受体发生内向化. 对于雌激素受体是否参与阿片肽受体内向化的调节，有人采用雌激素受体α和β敲除小鼠进行研究发现对于雌激素受体β敲除小鼠和野生型小鼠，雌激素可以使小鼠的视前核神经元的MOR发生内向化；而雌激素受体α敲除小鼠无此现象. 当加入选择性MOR配体endomorphin1可以引起MOR内向化，说明雌激素受体α敲除的小鼠视前核的MOR具有受体功能，也阐明了雌激素受体α是介导雌激素使MOR内向化的功能性受体［9］. 然而除了雌激素能够促进阿片肽受体内向化而使细胞膜受体数量减少外，对于雌激素能否调节阿片肽受体mRNA的水平尚无报道. 本实验采用半定量RTPCR和Western blot的方法首次发现雌激素减少CNE2细胞κOR蛋白的含量与抑制mRNA转录有关. 因此，我们认为雌激素调节细胞膜阿片肽受体的数量除了使受体发生内向化外，还可能从基因水平调节阿片肽受体的产生. 本实验的结果也为进一步研究雌激素对阿片肽受体的调节提供了实验依据.

【参考文献】

［1］ Donny EC, Caggiula AR, Rowell PP, et al. Nicotine selfadministration in rats: estrous cycle effects, sex differences and nicotinic receptor binding ［J］. Psychopharmacology, 2000,151(4):392-405.

［2］ Lynch WJ, Roth ME, Mickelberg JL, et al. Role of estrogen in the acquisition of intravenously selfadministered cocaine in female rats ［J］. Pharmacol Biochem Behav， 2001,68(4):641-646.

［3］ Roth ME, Casimir AG, Carroll ME. Influence of estrogen in the acquisition of intravenously selfadministered heroin in female rats ［J］. Pharmacol Biochem Behav, 2002,72(12):313-318.

［4］ Maggi R, Ma ZQ, Pimpinelli F, et al. Decrease of the number of opioid receptors and of the responsiveness to morphineduring neuronal differentiation induced by 17betaestradiol in estrogen receptortransfected neuroblastoma cells (SKER3) ［J］. Neuroendocrinology, 1999,69(1):54-62.

［5］ Diao CT, Li L, Lau SY, et al. kappaOpioid receptor potentiates apoptosis via a phospholipase C pathway in the CNE2 human epithelial tumor cell line ［J］. Biochim Biophys Acta, 2000,1499(12):49-62.

［6］ Ceccarelli I, Fiorenzani P, Grasso G, et al. Estrogen and muopioid receptor antagonists counteract the 17 betaestradiolinduced licking increase and interferongamma reduction occurring during the formalin test in male rats ［J］. Pain, 2004,111(12):181-190.

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［8］ Slamberova R, Rimanoczy A, Bar N, et al. Density of muopioid receptors in the hippocampus ofmale and female rats is altered by prenatalexposure and gonadal hormone treatment ［J］. Hippocampus, 2003,13(4):461-471.

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