人参三七川芎提取物对复制性衰老血管平滑肌细胞骨架蛋白微丝的影响

[摘要]观察人参三七川芎提取物对复制性衰老血管平滑肌细胞骨架蛋白微丝F-actin和G-actin的影响。以人主动脉平滑肌细胞（HASMC）作为研究对象，复制性衰老9代细胞作为衰老模型，实验分为青年组（5代细胞）、模型组（9代细胞）、中药低剂量组（100 mg・L-1）、中药中剂量组（200 mg・L-1）、中药高剂量组（400 mg・L-1）及白藜芦醇组（10 μmol・L-1），药物干预时间为48 h。应用β-半乳糖苷酶特异染色法计算蓝染细胞比率，CCK-8检测细胞增殖能力，流式细胞技术分析细胞周期，免疫荧光染色观察细胞F-actin和G-actin形态的改变，Western blot 检测F-actin蛋白的表达情况。与模型组相比，中药各给药组及白藜芦醇组可以有效的降低β-半乳糖苷酶染色蓝染细胞数量，提高细胞的增殖能力，减少G0/G1期的细胞数量，同时增加S期的细胞数量，减少F-actin蛋白的表达量及应力纤维的形成，且药物干预效果明显，具有统计学意义。复制性衰老的血管平滑肌细胞可以作为衰老研究的模型，细胞骨架微丝蛋白G-actin和F-actin形态及蛋白表达在细胞衰老过程中改变明显，人参三七川芎提取物对细胞G-actin和F-actin有明显干预作用，其可能间接通过此作用延缓了血管老化的进程。

[关键词]衰老； 血管老化； 细胞骨架；人参三七川芎提取物

[Abstract]To observe the effect of extracts of ginseng， notoginseng， and Chuanxiong Rhizome on the cytoskeleton protein F-actin and G-actin of the replicative senescence vascular smooth muscle cells， with human aortic smooth muscle cells （HASMC） as the research object， and the replicative senescence 9th generation cells as the senescence models， the experiment was divided into youth group （5th generation cells）， model group （9th generation cells）， Chinese medicine low dose group （100 mg・L-1）， middle dose group （200 mg・L-1）， and high dose group （400 mg・L-1） and resveratrol group （10 μmol・L-1）. The intervention time was 48 h. β-Galactosidase specific staining method was used to calculate the ratio of blue dyeing cells. CCK-8 method was used to detect the cells proliferation. The flow cytometry was used to analyze the cell cycle. Immunofluorescent staining was used to observe morphological changes of F-actin and G-actin. The western blot assay was used to determine the expression of F-actin protein. Compared with the model group， the Chinese medicine groups and resveratrol group significantly reduced the number of blue dyeing cells， improved the ability of cells proliferation， reduced the number of cells in G0/G1 phase， increased the number of cells in S phase， and reduced the protein expression of F-actin and the formation of stress fibers， with obvious intervention effect and statistically significant difference. Therefore， the replicative senescence vascular smooth muscle cells can be used as the models for senescence research， with significant changes in morphology and protein expression of cytoskeleton protein F-actin and G-actin in the process of cells aging. The extracts of ginseng， notoginseng， and Chuanxiong Rhizome have obvious intervention effect on F-actin and G-actin， and it might be indirectly associated with delaying the aging of blood vessels.

[Key words]senescence； vascular aging； cytoskeleton； extracts of ginseng， notoginseng， and Chuanxiong Rhizoma

目前我国已进入老龄化社会，且形势十分严峻，预计到2050年，老龄化将达到峰值，65岁及以上人口将超过3亿，占总人口的20%以上[1]。衰老是疾病发生重要的决定性因素[2]，能够加速心血管疾病的其他危险因子。血管老化是人体衰老发生的关键因素，不仅导致动脉粥样硬化的发生，促进机体衰老的进程，而且可以诱发多种疾病[3]。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）作为血管壁中膜的主要细胞成分，其表型转化及伴随出现的生物学行为改变是血管老化的重要病理学基础[4]。目前有研究表明，细胞骨架的动态改变是促使平滑肌细胞迁移、增殖及表型变化的重要细胞内信号[5]。肌动蛋白（actin）是细胞骨架微丝的主要成分，通常以单体（G-actin）或聚合体（F-actin）形式存在于细胞内，是研究 VSMCs中细胞骨架改变的重要检测指标，且其表达变化受细胞内相关信号因子的调控，如热休克蛋白27（heat shock protein 27，HSP27）、整合素蛋白和凝溶胶蛋白等[6]，其中HSP27调控作用最为肯定。

本课题组一直致力于益气活血中药延缓血管老化的研究，对增龄导致的生理性血管老化和高血压病导致的病理性血管老化进行了较系统的研究，同时，明确了益气活血中药延缓血管老化的一些关键作用机制，比如抗氧化应激、抗AngⅡ干预等，并明确了益气活血中药对血管老化的干预疗效。本研究以人主动脉平滑肌细胞骨架的微丝蛋白F-actin和G-actin为对象，观察益气活血中药人参三七川芎提取物对骨架蛋白F-actin和G-actin的干预作用，为进一步研究细胞骨架与血管老化的关系提供实验依据。

1材料

人主动脉平滑肌细胞HASMC（美国Sciencell公司，Cat No：6110，Lot No：7463）。

SMCM基础培养基（美国Sciencell公司）；胎牛血清（FBS，美国Sciencell公司）；生长因子（SMCGS，美国Sciencell公司）；双抗P/S Solution（美国Sciencell公司）；DPBS溶液（美国Sciencell公司）；细胞冻存液CFM（美国Sciencell公司）；胰酶/EDTA消化酶（美国Sciencell公司）；细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶检测试剂盒（杰美基因医药上海科技有限公司）；细胞DNA含量检测试剂盒（细胞周期）（南京凯基生物科技发展有限公司）；CCK-8增殖试剂盒（上海东仁公司）；4%多聚甲醛（北京索莱宝公司）；Triton X-100穿透液（北京索莱宝公司）；罗丹明鬼笔环肽（美国Molecular Probes）；Alexa Flour 488（美国Molecular Probes）；二甲基亚砜（DMSO，北京索莱宝公司）；噻唑蓝MTT（北京索莱宝公司）；小鼠F-actin单克隆抗体（英国Abcam公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（上海碧云天生物技术公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术公司）；超敏ECL化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术公司）；高效RIPA组织/细胞裂解液（北京索莱宝公司）。

人参、三七、川芎合剂冻干粉由北京因科瑞斯医药科技公司制备提供。药物均为道地药材，单味药成分检测符合药典的规定和标准，按3∶2∶4破碎成最粗粉，经乙醇回收提取，滤过，药渣弃去，醇提液回收乙醇至无醇味浓缩液，继续浓缩至稠膏，真空减压，干燥至干膏，粉碎装袋，每1 g冻干粉含生药4.286 g。中药冻干粉用PBS配制成贮存液，以0.22 μm滤器过滤并分装，质量浓度25 g・L-1，-20 ℃保存。白藜芦醇（中国食品药品检定研究院，批号111535-200502）用DMSO溶解并配制成贮存液，质量浓度50 g・L-1 ，4 ℃保存。

倒置相差显微镜及成像系统（德国Leica，型号4000B）；流式细胞仪（美国Beckmam，型号Cytomics FC500）；全自动酶标仪（美国Thermo，型号Multiskan MK3）；激光共聚焦显微镜（日本Olympus，型号FV1000）；发光凝胶成像系统（SYNGENE，型号GeneGnome XRQ）。

2方法

2.1细胞培养及传代细胞培养一般隔天换液，待培养瓶细胞密度在90%以上时进行传代，弃去原培养基，用DPBS洗2次；加入1 mL DPBS与胰酶/EDTA混合液（比例为1∶4）；室温放置1.5 min，待细胞变圆时，轻敲瓶底，后加入2 mL完全培养基停止消化，用吸管进行吹打，收集细胞，1 000 r・min-1离心5 min，弃上清加入培养基2～3 mL吹悬，按照1∶2或1∶3传代培养。

2.2分组及药物浓度 实验分为6组，分别为青年组（5代细胞）、模型组（9代细胞）、中药低剂量组（100 mg・L-1）、中药中剂量组（200 mg・L-1）、中药高剂量组（400 mg・L-1）及白藜芦醇组（10 μmol・L-1），药物干预时间为48 h。

2.3β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色鉴定衰老的程度 β-半乳糖苷酶染色法是鉴定细胞衰老的重要指标[7]。将细胞以8×103个/孔接种于24孔板，次日细胞贴壁后，实验组给予药物干预，作用时间为48 h。实验前将GENMED染色液与GENMED稀释液以1∶20配制成工作液，混匀，置入37 ℃水浴箱预热。吸去原细胞培养基，加入500 μL/孔的GENMED清理液，并轻微摇晃24孔板；吸去清理液，加入500 μL/孔的GENMED固定液，室温孵育5 min；吸去固定液，加入500 μL/孔的GENMED酸性液，清洗细胞表面，并重复此操作一次；加入400 μL/孔预热的工作液，37 ℃孵育过夜，次日在光学显微镜下观察并计数，随机选取3个视野，计算蓝色细胞的数量占总视野细胞数量的比值。

2.4CCK-8检测细胞增殖能力将细胞以6×103个/孔接种于96孔板，每组设5个复孔，次日细胞贴壁后，实验组给予药物干预，作用时间为48 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，放入37 ℃培养箱中孵育2 h，上机检测，记录酶标仪所测定450 nm波长的吸光度（A）。

2.5流式细胞仪分析细胞周期常规进行细胞培养，实验组药物干预48 h，消化后离心并用DPBS洗涤2次，去除上清，每组加入70%冰乙醇1 mL吹悬固定，4 ℃保存过夜。次日离心后去除固定液，DPBS洗涤1次，离心去上清，每组加入100 μL RNase A 37 ℃水浴30 min，再加入400 μL PI混匀染色，4 ℃冰箱避光放置30 min，后上机检测。

2.6激光共聚焦显微镜观察细胞F-actin和G-actin结构的改变将细胞以6×103个/孔接种于黑色96孔板，贴壁后，实验组药物干预48 h。吸去原培养基，用DPBS清洗细胞2次，加入4%多聚甲醛100 μL/孔，室温下固定15 min，再用DPBS清洗细胞5 min×3遍；加入0.1% Triton X-100 100 μL/孔，室温下穿透5 min，再用DPBS清洗5 min×3遍；最后加入罗丹明鬼笔环肽2.5 μL（0.5 U）/孔和Alexafluor488 DNase I 2 μL/孔共染色，避光室温放置30 min，再用DPBS清洗5 min×3遍，上机观察F-actin和G-actin的形态学改变。

2.7Western blot 检测F-actin蛋白的表达细胞样品中加入100 μL含蛋白酶抑制剂、PMSF的RIPA 裂解液，超声波破碎仪破碎10 s，4 ℃16 000×g离心10 min，按BCA蛋白浓度检测试剂盒说明书对样品蛋白总浓度进行测定，加入样品1/4体积的5×Loading buffer，100 ℃加热10 min。进行电泳及转膜后，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，完成后用TBST洗膜3次，一抗稀释比例1∶250，4 ℃水平摇床孵育过夜。二抗用5%脱脂奶粉封闭液稀释，稀释比例1∶3 000，室温孵育60 min，TBST洗涤3×10 min。将膜平铺在干净的保鲜膜上，滴加配置好的ECL反应液反应2 min，曝光及扫描。

2.8统计学分析应用SPSS 18.0软件进行统计分析，其中计量数据以±s表示，多组样本采用单因素方差分析，用Levene法检验方差齐性，若方差齐，采用LSD法进行两两比较；若方差不齐，则采用Tamhane法。以P

3结果

3.1对SA-β-gal衰老染色的影响通过对各组染色结果的观察和计数，与青年组相比，模型组细胞蓝染数比例增多，具有显著性差异；与模型组相比，中药低、中、高剂量组及白藜芦醇组细胞蓝染数比例均明显降低，均有显著性差异（图1，表1）。

3.2对细胞增殖能力的影响各组CCK-8细胞增殖能力的检测表明，与青年组相比，模型组A明显减少，具有显著性差异；与模型组相比，中药中剂量组A明显增加，具有显著性差异，中药低剂量组A增加，具有差异性，而中药高剂量组及白藜芦醇组A增加，但无统计学意义（表1）。

3.3对细胞周期的影响通过对各组流式细胞周期的检测表明，与青年组相比，模型组G0/G1期细胞明显增多，S期细胞减少，均有显著性差异；与模型组相比，中药中、高剂量组及白藜芦醇组G0/G1期细胞明显减少，S期细胞增多，具有显著性差异，中药低剂量组则无统计学意义；G2/M期细胞数目变化均无统计学意义（表2）。

A.青年组；B.模型组；C.中药低剂量组（100 mg・L-1）；D.中药中剂量组（200 mg・L-1）；E. 中药高剂量组（400 mg・L-1）；F.白藜芦醇组（10 μmol・L-1）（图2，3同）。

3.4对细胞F-actin和G-actin形态学的影响激光共聚焦显微镜显示，青年组细胞排列紧密，F-actin（红染）主要在细胞表面及外周分布，线条完整连续；G-actin（绿染）主要在细胞的中央区域分布，呈致密的椭圆形，染色清晰、饱满、圆润。模型组细胞体积变大，形态不规则，F-actin边缘毛糙不规整，出现锯齿样断裂，部分呈纵向平行排列，形成大量应力纤维；G-actin向细胞周边区域伸展，部分出现边缘变模糊呈絮状，细胞中央区域染色变弱。模型组与青年组相比，F-actin/G-actin荧光强度比值增大，具有显著统计学差异。各给药组F-actin边缘较模型组清晰光滑，且较少断裂；G-actin则主要集中于细胞中间，染色略欠饱满，尚清晰圆润。与模型组相比，中药低、中剂量组及白藜芦醇组F-actin/G-actin荧光强度比值降低，具有统计学意义，中药高剂量组则无统计学意义（图2，表3）。

3.5对F-actin和HSP27蛋白表达的影响与青年组相比，模型组的F-actin蛋白表达明显增多，具有显著差异性；与模型组相比，中药中、高剂量组及白藜芦醇组F-actin蛋白表达减少，具有显著差异性；与青年组相比，模型组HSP27蛋白表达明显减少，具有显著差异性；与模型组相比，中药低、中、高剂量组及白藜芦醇组HSP27蛋白表达明显增多，具有显著差异性（图3，表3）。

4讨论

衰老是不可抗拒的自然规律，而血管衰老是人体衰老的关键始发因素[8]。 在血管老化的过程中，中膜平滑肌细胞高增殖、高移行、分泌性改变是内膜增厚、血管重构的关键因素。VSMC发生表型转化的过程中伴随着细胞骨架的重构，同时骨架重构又是VSMC由收缩型向合成型转化过程中细胞收缩能力下降、发生迁移和黏附等改变的病理生理基础[4]。肌动蛋白是构成细胞骨架微丝的基本成分，以单体G-actin或聚合体F-actin形式存在，肌动蛋白具有收缩、保持细胞的形状、运动、细胞间黏附等多种功能，同时参与细胞增殖过程[9]。有研究表明，调节机体衰老的多条通路均与F-actin的改变密切相关，如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路、胰岛素/胰岛素样生长因子（IGF-1）通路和去乙酰化酶（SIRTS）通路等[10-12]。

气血是构成机体的基本物质，二者关系密切，随着衰老的进行，气虚血不行，血虚气不化，气虚血少，气血运行不畅，最终导致气虚血瘀之证，从而加速了机体衰老的进程。中药人参、三七、川芎合方属于益气活血治法的范畴，在心脑血管疾病中被广泛应用，三药合剂具有延缓血管衰老、保护血管内皮细胞及调节血管活性物质等作用[13-14]。白藜芦醇具有激活SIRT1通路、抗氧化、调节自噬及保持端粒酶活性等作用，是目前比较公认的延缓衰老的对照药物。

本研究以复制性衰老的血管平滑肌细胞为对象，以β-半乳糖苷酶染色、CCK-8细胞增殖活性和细胞周期作为判断细胞衰老程度的指标，并观察人参三七川芎提取物延缓细胞衰老的作用。实验结果表明衰老的细胞多停滞在细胞周期的G1期，S期细胞数量则减少，且体外增殖能力相对减弱，同时形态学表现出细胞扁平、胀大、颗粒增多的特征，并且在酸性环境下，细胞内β-半乳糖苷酶活性增加，表现为细胞蓝染数目增多。药物干预后，停滞在G1期的细胞数量减少，同时S期细胞数量增加，且β-半乳糖苷酶染色细胞蓝染数目减少，表明人参三七川芎提取物具有延缓血管平滑肌细胞衰老的作用。细胞骨架方面，青年组细胞微丝结构以单体G-actin为主，主要在细胞的中央区域分布，呈致密的椭圆形，染色清晰、饱满、圆润；聚合体F-actin主要在细胞表面及外周分布，线条完整连续。模型组G-actin向细胞周边区域伸展，部分出现边缘变模糊呈絮状，细胞中央区域染色变弱；F-actin边缘毛糙不规整，出现锯齿样断裂，部分呈纵向平行排列，且蛋白表达量增加，形成大量应力纤维。药物干预后，F-actin边缘较模型组清晰光滑，且较少断裂，蛋白表达量减少；G-actin则主要集中于细胞中间，染色略欠饱满，尚清晰圆润。而HSP27作为细胞骨架蛋白的主要调控因子，反向调节着F-actin的表达。

综上所述，复制性衰老的血管平滑肌细胞可以作为衰老研究的模型；细胞骨架微丝蛋白G-actin和 F-actin形态及蛋白表达在细胞衰老过程中改变明显，其可能直接参与平滑肌细胞由收缩型向合成型转化等衰老的进程；人参三七川芎提取物可以一定程度上延缓血管老化，且对于细胞G-actin和 F-actin有明显干预作用，其可能间接通过此作用延缓了血管老化的进程。

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