卵泡细胞发育医学检验论文

一、材料和方法

（一）卵泡的采集和组织切片。

从有规则产蛋周期的三黄母鸡中取出等级前卵泡，按照其直径分为小白卵泡（SWF，1～3mm）、大白卵泡（LWF，3～5mm）、小黄卵泡（SYF，5～6mm）和大黄卵泡（LYF，6～9mm）。各级卵泡用4%多聚甲醛固定24h，然后切片，片厚5μm。经HE染色后在显微镜下观察组织结构并用显微数字成像系统摄像，将图像传送到计算机中。用SimplePCI高级图像分析软件测量卵泡颗粒层和膜层的厚度，以及颗粒细胞的密度。

（二）卵泡的培养和激素处理

等级前卵泡取出后，用生理盐水漂洗干净，以1卵泡/孔的密度接种于24孔培养板。根据卵泡直径将发育阶段相近的卵泡随机分为2组，即对照组和FSH处理组。培养液为含0.5％胎牛血清（FCS）的M199培养液（Hyclone）。预培养16h后，撤去血清，换用含10μg/mL胰岛素、5μg/mL转铁蛋白和3×10-8mol/L亚硒酸钠的ITS培养液。培养液还添加了1.75mmol/LHepes、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。卵泡置于39℃，5％CO2的培养箱中继续培养。在培养的同时用10ng/mLFSH处理48h。每个处理组4孔，实验重复3次。

（三）5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷免疫组织化学

卵泡悬浮培养48h后加入终浓度为15μg/mL的BrdU，继续培养4h，然后用4%多聚甲醛固定，进行切片。切片用3%H2O2温育30min灭活内源性过氧化物酶，室温下用山羊血清封闭20min后加入甲酰胺100℃变性核酸5min，冰水浴冷却后，加入小鼠抗BrdU抗体，4℃过夜后滴加羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育20min，用DAB显色剂室温显色，阳性细胞呈棕红色，计算出阳性细胞的百分比。

（四）数据分析

所得数据采用SAS软件中GLM过程进行方差分析和Duncan氏多重比较，检验误差为5％和1％水平。

二、实验结果

（一）等级前卵泡膜层和颗粒层的形态学变化

等级前卵泡组织学研究结果表明，SWF只有1层颗粒细胞，LWF中出现2层颗粒细胞，而SYF和LYF中则有多层颗粒细胞。基膜外侧的结缔组织分化形成卵泡膜层，其中的膜细胞则随着卵泡级别的增加而成为多层，并分化为内膜细胞层和外膜细胞层。同时数据统计显示，卵泡膜层和颗粒层厚度随着卵泡直径的变大而显著增加，并且颗粒细胞的密度也呈现相似的变化趋势

（二）等级前卵泡颗粒细胞BrdU标记指数的变化

等级前卵泡BrdU掺入实验结果表明，随着卵泡直径增加，颗粒细胞BrdU标记指数显著增加，即颗粒细胞的增殖活性随等级前卵泡的发育而增强。

（三）FSH对卵泡细胞增殖的影响

等级前卵泡用10ng/mLFSH处理48h，然后进行的组织学研究和数据统计分析结果表明，与对照组相比，FSH处理组LYF中颗粒层的厚度增厚19.7%。随着FSH处理剂量的增加，SYF和LYF中颗粒细胞的密度分别增加25.7%和30.3%。但是在卵泡体外培养过程中，FSH处理后卵泡膜层的厚度则没有显著变化。

三、结论

卵巢中卵泡是生长最快的正常组织之一，而与卵母细胞一起构成卵泡的体细胞的发育则是其生长的主要原因。本实验对产蛋母鸡等级前卵泡的组织切片结果显示了小卵泡中卵泡细胞的发育进程。SWF仅有1层立方状的颗粒细胞，与卵母细胞组成初级卵泡；LWF、SYF和LYF中颗粒层细胞增至2～3层，并且颗粒细胞数目显著增加，从而形成次级卵泡。本实验还显示，随着卵泡体积的增加，膜细胞增殖为多层并分化为功能完全不同的内膜细胞和外膜细胞层。以上结果表明卵泡体细胞的生长变化是卵泡发育的重要标志。FSH在维持和调节卵泡的发育中起着重要作用。FSH可促进卵巢颗粒细胞的增殖。用碘化FSH作自显摄研究证实，FSH的结合部位首先出现在颗粒细胞，可见卵巢中主要是颗粒细胞表达FSH受体。FSH以剂量-效应关系促进鸡颗粒细胞的增殖。最近的研究报道，FSH通过Akt信号途径上调细胞周期蛋白D2的表达和抑制AMPK的活性，最终刺激颗粒细胞的增殖。本实验采用体外卵泡悬浮培养，研究了FSH对卵泡细胞增殖的影响。结果表明，10ng/mLFSH显著增加SYF和LYF中颗粒层的厚度以及颗粒细胞的密度，但FSH对卵泡膜细胞则没有显著的促增殖作用。由此可见，FSH对小卵泡的发育具有阶段和细胞类型特异性，即FSH显著促进即将进入等级前卵泡中颗粒细胞的增殖，从而加速卵泡的发育。总之，本实验通过体内和体外研究显示了等级前卵泡中膜细胞和颗粒细胞的形态学变化，并证明FSH能显著刺激SYF和LYF中颗粒细胞的增殖，促使等级前卵泡进入等级发育。