时间：2022-08-30 10:23:07
[摘要]目的：探讨结缔组织生长因子（CTGF）在植皮术后残余创面中的表达情况及可能的意义。方法：应用免疫组化（IHC）和半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测创面组织中CTGF蛋白和mRNA的表达。结果：CTGF蛋白及mRNA在残余创面组织中高度表达，CTGF阳性颗粒面密度及mRNA指数分别为（0.512±0.054）和（0.91±0.23），与正常皮肤组织比较差异有统计学意义（P
[关键词]残余创面；结缔组织生长因子；逆转录聚合酶链反应；免疫组化
[中图分类号]R622Q 813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2009）02-0194-03
Expression and effectiveness of connective tissue growth factor in residual wound
after skin grafting
YU Wenlin, BI Yuan, CHENG Biao, LI Qin, YANG Chuan-hong, LIU Hong-wei, ZENG Dong
（*Department of Plastic surgery, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Region, Guangzhou 510010, Guangdong, China）
Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of connective tissue growth factor(CTGF) in residual wound tissue after skin grafting.MethodsThe CTGF protein and mRNA were detected in residual wound tissue by immunohistochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) respectively.ResultsCompared with normal skin tissue, CTGF protein and mRNA were over-expressed in residual wound tissue. The area density value and mRNA index of CTGF were （0.512±0.054） and （0.91±0.23） respectively, which were significantly higher than that of normal skin tissue (P
Keywords:residual wound;connective tissue growth factor;reverse transcription polymerase chain; immunohistochemistry
不论是烧伤后切、削痂植皮，肉芽创面植皮，还是瘢痕切除后植皮，都可能因为皮片不完全存活而遗留残余创面。在这种创面愈合过程中，可能有多种生长因子参与并发挥作用，如TGF、EGF、FGF、IGF等[1]。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor， CTGF)有促进成纤维细胞增殖，细胞外基质沉积的作用[2]。正常皮肤组织极少表达CTGF，但皮肤创伤或炎症可诱导CTGF呈强表达[3]，说明CTGF可能在创面愈合的过程中起到重要作用。我们通过检测CTGF在植皮术后残余创面组织中的表达情况，试图揭示CTGF在创面愈合过程中的作用。
1材料和方法
1.1标本来源：实验标本分为植皮术后残余创面组、创面愈合组和正常皮肤组织组。所有标本均来源于我科因植皮术后有残余创面需行再次植皮整复手术的患者，共10例，年龄17～47岁。再次植皮整复手术时间为首次术后10-20d，残余创面组标本于再次整复时切取，创面愈合组标本于再次植皮愈合3个月后切取，正常皮肤组于再次植皮时在取皮区切取。残余创面局部无感染，均未进行过任何药物治疗，亦无传染、免疫、遗传和皮肤等疾病。标本切取时均征得患者同意。所有标本均分为两份，一份大小约1mm×3mm，置入4%中性甲醛中固定；另一份约0.2～0.3kg放入无RNA酶的专用离心管中，立即置入液氮中冷冻保存。
1.2 主要试剂：CTGF羊抗人多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗羊即用型SABC免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购自迈新公司。Trizol液及反转录试剂盒均购自美国promega公司，Taq酶和DNA分子标准均购自TaKaRa公司。
1.3方法
1.3.1HE染色：按常规方法进行。
1.3.2 免疫组织化学染色：按照即用型SABC免疫组化染色说明书进行，兔血清封闭，微波抗原修复，山羊抗人CTGF多克隆抗体稀释度为1:200，DAB显色，PBS代替一抗作为空白对照。半数切片不经苏木素复染，留作图像分析，其余切片经苏木素复染。用图像分析系统在20倍物镜下每张切片自表皮层向真皮层按系统抽样法随机抽取5个视野，测定阳性颗粒的总面积，然后计算出面密度。
1.3.3 RT-PCR检测CTGF mRNA表达：标本各取100mg组织，置于研钵的液氮中研磨，收集并用1ml Trizol液裂解组织，氯仿、异丙醇提取总RNA，用紫外分光光度计测定RNA样品纯度（A260/A280为1.8～2.0），反转录及PCR反应按试剂盒说明书进行。CTGF上游引物：5'-AACTATGATTAGAGCCAACTGCCTG-3'，下游引物：5'-TCATGCCATGTCTCCGTACATCTTC-3'，产物475bp，退火温度55℃。以管家基因GAPDH为内参照，上游引物：5'-GGTCGGAGTCAACGG ATTTGGTCG-3'，下游引物：5'-CCTCCGACGCCTGCTTCACCAC-3'，产物788bp，退火温度54.5℃。PCR扩增条件为94℃预变性5min，接着30个扩增循环：94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，然后72℃延伸10min，总体积为30μl。PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳后，用Bio-RAD凝胶扫描仪分析DNA电泳条带的光密度值，并计算mRNA指数（RI）=CTGF mRNA RT-PCR产物光密度值/GAPDH mRNA RT-PCR产物光密度值，以RI作为组织中CTGF mRNA的相对含量。
1.4统计学处理：实验所得数据用SPSS 10.0软件进行分析，以均数±标准差（x±s）表示。两样本比较用t检验对数据进行统计分析，以P
2结果
2.1HE染色：与正常皮肤组织相比，创面浅层胶原纤维呈玻璃样变，其深层毛细血管增生、轻度扩张充血，成纤维细胞数目增多，排列紊乱，并有中性粒细胞和大量淋巴细胞浸润，混杂有少数巨噬细胞，尤以毛囊、汗腺等附属器附近最为显著。残存的皮肤附件上皮细胞纵向增殖，继而呈舌状向创面爬行、覆盖，创缘的成纤维细胞和内皮细胞亦显示增生活跃。
2.2免疫组织化学染色：CTGF蛋白染色阳性信号为棕黄色颗粒，定位于细胞浆，空白对照无棕黄色着色。创面浅层大量成纤维细胞内有显著的阳性信号，部分内皮细胞和深层成纤维细胞中有少量阳性信号，毛根鞘细胞、毛球基质细胞和皮脂腺细胞中均可见阳性信号（图1A）。创缘表皮基底细胞和大部分角质形成细胞亦可见阳性信号，创缘真皮层中可见大量弥漫性分布的有阳性信号的成纤维细胞，着色较深，排列紊乱（图1B）。正常皮肤真皮层中CTGF蛋白表达阳性的成纤维细胞明显减少，着色亦较浅，排列较规则。创面愈合组仅真皮层部分成纤维细胞可见少量阳性信号。两组CTGF蛋白阳性颗粒分布面密度见表1、图2。创面CTGF表达明显高于创面愈合组及正常皮肤（P
2.3 CTGF mRNA表达：管家基因GAPDH在三组组织标本中的转录水平较为恒定，可作为CTGF PCR产物的相对定量标准。两组标本经RT-PCR扩增，产物经电泳分离并在紫外灯下观察，可见在788bp及475bp位置上各出现一特异性条带，与预期扩增片段长度相符，提示为特异性的CTGF和GAPDH cDNA。CTGF和GAPDH mRNA的RT-PCR产物电泳结果见图3，两组的RI值见表1、图2。创面组的RI值与创面愈合组及正常皮肤组织组比较差异有统计学意义（P0.05）
3讨论
创面愈合是一个由多种细胞、生长因子和细胞外基质之间相互作用的复杂的病理生理过程。尽管创面愈合的过程表现为炎性细胞浸润，修复细胞迁移、增殖和细胞外基质合成等一系列以细胞活动为主的变化，但实质上是多种生长因子和细胞因子对上述细胞功能活动发挥精细调节的复杂过程。
研究发现，转化生长因子β1（TGF-β1）在创面愈合过程中起着重要的作用。能直接刺激成纤维细胞合成基质蛋白(包括纤维连接蛋白)、胶原、胺基葡糖等。并对新合成的细胞基质的降解具有明显的抑制作用，对上皮细胞具有趋化作用。此外TGF-β1是刺激创面肉芽组织形成最有效的细胞因子，对表皮创面愈合有明显促进作用，可增加伤口组织抗张强度和促使新血管再生[4]。最近，大量的研究发现CTGF在许多病理情况下与TGF-β1的表达同步增高，并证实CTGF是TGF-β1的下游效应因子[2]。
目前，对于创面愈合后瘢痕组织中CTGF的表达情况有较多研究：在病理性瘢痕组织中CTGF呈现特征性的高表达，表达程度与瘢痕增生程度呈成正相关。在瘢痕的成熟期CTGF的表达明显下降，甚至检测不出[5-7]。这些结果表明病理性瘢痕中CTGF的表达程度与成纤维细胞的增殖和细胞外基质的合成程度呈正相关。然而，目前尚未见CTGF在创面愈合过程中的动态变化情况的报道。在创面愈合的炎症期、增殖期和塑形期等三个过程中的表达规律尚不清楚。创面愈合的增殖期表现为大量的修复细胞增殖和分化，大量新生血管和成纤维细胞及其合成的基质形成肉芽组织。为探讨此时的创面组织是否有CTGF的高表达，我们利用植皮残余创面的实验研究结果表明，在正常皮肤细胞内有极少量的CTGF基因表达，创面愈合的增生修复期，创面成纤维细胞及创缘皮肤基底细胞和角质形成细胞内有强CTGF阳性信号表达。当创面修复后，组织内CTGF的表达水平恢复至正常水平。动物实验已经证明，在创面第三天组织中富集了大量的中性粒细胞，不断产生TGF-β1，达到高峰，随着炎症期向增生期过渡，TGF-β1的表达逐渐下降，但仍高于正常水平；而CTGF的表达在创面第九天达到高峰[8]。结合我们的实验结果可以认为：创面组织产生TGF-β1，诱导成纤维细胞和血管内皮细胞过度表达CTGF，成纤维细胞和血管内皮细胞又可通过自分泌和旁分泌的机制促进CTGF的表达达到高峰，CTGF从而促进成纤维细胞增殖、分化、血管增生和细胞外基质的沉积，这与创面愈合的增殖期肉芽组织长入的时间相吻合。随着增殖期的结束，创面修复完成，进入到塑形成熟期后，CTGF的表达逐渐降至正常水平。
综上所述，在创面愈合过程中，CTGF基因有明显表达，其表达规律性和创面愈合时间有密切关系，可能在不同的愈合时间所起的作用有所不同，提示CTGF在创面愈合过程中发挥着重要作用。但CTGF在创面愈合过程中的动态规律性变化特点尚需要进一步的动物实验观察。
[参考文献]
[1]邓辰亮，杨光辉，曹谊林. 生长因子促皮肤创面愈合的研究进展[J]. 组织工程与重建外科， 2006，2（3）：174-176.
[2]余文林，李勤. 结缔组织生长因子与病理性瘢痕[J]. 中国美容医学，2007，16（7）：1013-1015.
[3]Leask A. Transcriptional profiling of the scleroderma fibroblast reveals a potential role for connective tissue growth factor (CTGF) in pathological fibrosis[J]. Keio J Med,2004,53(2):74-77.
[4]王振宜,章云,李斌. TGF-B在创面愈合及瘢痕形成[J]. 中国中西医结合外科杂志，2004，10（6）：463-464.
[5]Igarashi A, Nashiro K, Kikushi K. Connective tissue growth factor gene expression in tissue sections from localized scleroderma, keloid, and other fibrotic skin disorders[J]. J Invest Dematol，1996，106 (4) : 729-733.
[6]杨贤金，张一鸣. CTGF在病理性瘢痕中的表达及意义[J]. 中国美容医学，2005，14(6):668-669.
[7]王少华，曹广信，王燕华，等. 病理性瘢痕中结缔组织生长因子的免疫组化研究[J]. 中国美容医学，2007，16(8)：1032-1035.
[8]Igarashi A, Okochi H, Bradham DM, et al. Regulation of connective tissue growth factor gene expression in human skin fibroblasts and during wound repair[J]. Mol Biol Cell, 1993，4(6):637-645.
[收稿日期]2008-10-14[修回日期]2009-01-08