尿毒清颗粒调控TGF β 1/SnoN/Smads信号通路改善肾衰竭模型鼠肾间质纤维化的作用和机制

[摘要] 为了初步阐明尿毒清颗粒（uremic clearance granule，UCG）在体内调控转化生长因子（transforming growth factor，TGF）β1/SnoN/Smads信号通路而改善肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）的作用和机制，将15只大鼠随机分为正常组、模型组、尿毒清组。采用腺嘌呤灌胃联合单侧输尿管结扎术（unilateral ureteral obstruction，UUO）建立肾衰竭模型。造模后，3组大鼠分别给予UCG悬浊液或蒸馏水，共3周，其间，检测大鼠体重、24 h尿蛋白排泄量（urinary protein excretion，Upro）；给药3周后，处死全部大鼠，抽取血液，摘除双肾，称重，观察肾脏外观和肾组织形态特征，检测血清生化指标和肾组织TGFβ1，SnoN，磷酸化Smad2/3（phosphorylated Smad2/3，pSmad2/3）以及Smad7蛋白表达量。结果表明，经UCG干预后，模型鼠一般情况，肾脏外观、血清肌酐（serum creatinine，Scr）、血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、尿酸（uric acid，UA）、白蛋白（albumin，Alb）、Upro以及肾组织形态均得到不同程度的改善；UCG还可以下调模型鼠肾组织TGFβ1，pSmad2/3蛋白表达水平，上调SnoN，Smad7蛋白表达水平。总之，UCG可能在体内多靶点地调控TGFβ1/SnoN/Smad信号通路，从而，减少细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成，延缓肾衰竭进展。

[关键词] 尿毒清颗粒； 肾衰竭； 肾间质纤维化； SnoN； 转化生长因子β1/Smads信号通路

Effects and mechanisms of UCG ameliorating renal interstitial fibrosis by

regulating TGFβ1/SnoN/Smads signaling pathway in renal failure rats

WU Wei1，2， HUANG Yanru 3， WAN Yigang2，4 *， YANG Haiming2， MAO Zhimin1， YANG Jingjing1， SHI Ge1， SUN Wei4 *

（1 Department of Traditional Chinese Medicine， Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of

Traditional Chinese and Western Medicine， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210008， China；

2 Department of Traditional Chinese Medicine， Nanjing Drum Tower Hospital， the Affiliated

Hospital of Nanjing University Medical School， Nanjing 210008， China；3 Division of Molecular

Signaling， Department of Advanced Biomedical Research， Interdisciplinary Graduate School of

Medicine and Engineering， University of Yamanashi， Yamanashi 4093898， Japan；

4 Research Institute of Kidney Disease， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210029， China）

[Abstract] This study was aimed to demonstrate preliminarily the effects and mechanisms of uremic clearance granule （UCG） ameliorating renal interstitial fibrosis （RIF） by regulating transforming growth factor （TGF）β1/SnoN/Smads signaling pathway in vivo Fifteen rats were randomly divided into 3 groups：the normal group，the model group and the UCG group The rats with renal failure were induced by intragastric administration of adenine and unilateral ureteral obstruction （UUO） After modeling，the rats in the UCG group and in the other groups were intervened by intragastric administration of UCG and distilled water respectively during 3 weeks The body weight and 24 h urinary protein excretion （Upro） in all rats were tested after drug administration All rats were killed after drug administration for 3 weeks，blood and kidneys were collected and weighted，kidney appearance and renal morphological characteristics were observed In addition，serum biochemical indices and the protein expressions of TGFβ1，SnoN，phosphorylated Smad2/3 （pSmad2/3） and Smad7 in the kidney were evaluated respectively The results indicated that，after the intervention of UCG，the general state of health，kidney appearance，serum creatinine （Scr），blood urea nitrogen （BUN），uric acid （UA），albumin （Alb），Upro and renal morphological change in model rats were improved in different degrees，respectively Moreover，UCG downregulated the protein expressions of TGFβ1 and pSmad2/3，and upregulated the protein expressions of SnoN and Smad7 in the kidney In conclusion，UCG reduces extracellular matrix （ECM） synthesis and delays the progression of renal failure via possibly multitargeting at regulating TGFβ1/SnoN/Smads signaling pathway in vivo

[Key words] uremic clearance granule； renal failure； renal interstitial fibrosis； SnoN； transforming growth factorβ1/Smads signaling pathway

doi：10.4268/cjcmm20161220

肾衰竭是各种慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）发展至终末期肾病的最终转归[1]。无论何种病因，在肾衰竭进展过程中，肾组织损伤都有其共同的病理基础，也就是肾纤维化，其中，肾间质纤维化程度与肾衰竭进展速度密切相关[2]。肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）主要表现为肾小管萎缩和管周毛细血管网匮乏、肾间质炎症细胞浸润、肌成纤维细胞活化和增生以及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度合成和异常沉积[34]。研究表明[56]，RIF典型的组织形态特征就是ECM合成和降解的失衡，而这一失衡的过程与致纤维化因子――转化生长因子（transforming growth factor，TGF）β1及其Smads信号通路密切相关。因此，抑制TGFβ1表达，调控TGFβ1/Smads信号通路活性，减少ECM合成等手段已成为国内外延缓肾衰竭进展的常规措施。

尿毒清颗粒（uremic clearance granule，UCG）是临床上治疗慢性肾衰竭（chronic renal failure，CRF）的常用中药复方制剂，具有健脾利湿、通腑降浊、活血化瘀等功效[7]。国内的临床研究表明，UCG可以改善CRF患者肾功能，延缓其进入肾替代治疗的时间[7]。笔者所属团队的前期研究显示，UCG改善肾功能的作用与其调节肾组织TGFβ1/Smads信号通路中关键信号分子表达而干预ECM失衡有关[8]。在RIF形成过程中，尽管致纤维化因子TGFβ1发挥着关键作用，但是，TGFβ1本身也是一个重要的抗炎因子，对于人类而言，TGFβ1的长期抑制可能会引发炎症等不利后果；对于鼠类动物模型，TGFβ1的缺乏直接会导致炎症相关性死亡[9]。因此，单纯地抑制TGFβ1表达并不是治疗RIF的理想方法。最近的研究表明，TGFβ1及其下游的Smads信号通路存在受体前后多个环节的负反馈调节机制，其中，Ski相关蛋白（Skirelated novel protein，SnoN）作为转录共抑制因子可以结合到激活的Smads复合物上而形成转录失活复合物，抑制TGFβ1靶基因的转录，负向调控TGFβ1表达，最终，影响脏器纤维化的形成和发展[1012]。据报道[13]，在糖尿病大鼠肾小管上皮细胞中的SnoN表达减少，Smad2/3磷酸化水平和TGFβ1表达水平增高，RIF明显加剧；而对于同样由链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病模型鼠，黄连素可以调控TGFβ1/SnoN/Smad信号通路的动态平衡，使肾组织中SnoN和Smad7蛋白表达增加，TGFβ1和Smad2/3蛋白表达减少[14]。据此，笔者推测，UCG改善RIF的作用还可能与Smads负性调节因子SnoN有关。基于大鼠肾衰竭模型，笔者试图从新的角度初步阐明UCG在体内调控TGFβ1/SnoN/Smads信号通路而改善RIF的作用和机制。

1 材料

11 动物

15只8周龄左右的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（SPF）购自总院动物中心（批号SLXK201112），饲养于南京大学医学院附属鼓楼医院（简称鼓楼医院）动物实验中心，所有大鼠均喂予标准饲料，并自由饮水，大鼠购回后适应性饲养1周。

12 药物制备

腺嘌呤（adenine）购自Sigma公司，将腺嘌呤（1 g）溶解于50 mL牛奶中，配制成20 g・L-1的腺嘌呤悬浊液。UCG购自广州康臣药业有限公司（批准文号Z10970122），将UCG（15 g）溶解于50 mL蒸馏水中，配制成30 g・L-1的UCG悬浊液。

13 试剂

全蛋白提取试剂盒，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒，蛋白相对分子质量标记物均购自凯基公司；蛋白上样缓冲液购自碧云天公司；脱脂奶粉购自伊利公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）显色液均购自Millipore公司；兔抗大鼠SnoN多克隆抗体，兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗体均购自Abcam公司；兔抗大鼠Smad7单克隆抗体，兔抗大鼠磷酸化Smad2/3（phosphorylated Smad2/3，pSmad2/3）单克隆抗体均购自Santa Cruz公司；小鼠抗大鼠甘油醛磷酸脱氢酶（glyceraldehyde3phosphate dihydrogenase，GAPDH）单克隆抗体以及辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔IgG抗体均购自Bioworld公司。

2 方法

21 模型制作方法

采用腺嘌呤灌胃联合单侧输尿管结扎术（unilateral ureteral obstruction，UUO）的方法建立大鼠肾衰竭模型。在实验开始的第1～14天进行腺嘌呤（150 mg・kg-1）灌胃；第15天，行左侧输尿管结扎手术。腹腔注射氯胺酮和地西泮等体积混合液（3 mg・kg-1），麻醉后，将大鼠固定于手术板上，取仰卧位，常规消毒，左腹部切口1～15 cm，逐层切开皮肤、肌肉，暴露左肾，钝性分离肾周脂肪，沿肾门部位寻找输尿管，在输尿管上、下段结扎，并于中间处剪断；分层缝合切口，予青霉素钠（20万U/只）腹腔注射，连续3 d。正常组大鼠不予任何干预。

22 分组和给药方法

将15只大鼠按随机数字表分为3组：正常组、模型组、尿毒清组，每组各5只。UCG的临床治疗量[7]为30 g・d-1，按动物标准换算公式，大鼠的有效量相当于每天5 g・kg-1。尿毒清组大鼠于术后第2天开始予UCG灌胃，正常组和模型组大鼠同时给予蒸馏水2 mL灌胃，每日1次，连续3周。各组大鼠自给药开始计时，第3周末，经腹腔注射氯胺酮麻醉，心脏穿刺处死，采集血液样本和肾组织而进行各项指标的检测。

23 观察指标及检测方法

231 一般情况 每天观察各组大鼠精神、饮食、饮水、皮毛色泽以及活动情况等；药物和蒸馏水干预前后，每周称量大鼠体重。

232 尿液、血清生化指标 药物干预后第3周末，分e将各组大鼠放入金属代谢笼，禁食，自由饮水，收集24 h尿液，倍比稀释后，采用考马斯亮蓝法测定24 h尿蛋白排泄量（urinary protein excretion，Upro）。次日，在氯胺酮麻醉状态下解剖大鼠胸腔，经心脏采血。采用全自动生化分析仪检测大鼠血清生化指标，包括血清肌酐（serum creatinine，Scr），血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN），尿酸（uric acid，UA），白蛋白（albumin，Alb），总胆固醇（total cholesterol，TC），甘油三酯（triglyceride，TG）等。

233 肾脏组织形态特征 解剖大鼠腹腔，自肾门处摘取两侧肾脏，肾脏摘除后，分离皮髓质，并取少量肾皮质（肾脏的上极或下极）固定于10%中性甲醛内，经脱水16 h后，石蜡包埋，切片3 μm，进行过碘酸雪夫（periodic acid schiff，PAS）染色；借助光学显微镜（光镜），观察肾间质ECM沉积程度；每张切片随机选取20个肾小球，采用病理图像分析系统Imagepro plus（IPP）计算肾间质ECM相对面积（ECM /肾间质面积）。

234 肾组织TGFβ1，SnoN，pSmad2/3，Smad7蛋白表达 采用Western blot检测肾组织TGFβ1，SnoN，pSmad2/3，Smad7蛋白表达量。从-80 ℃冰箱中取出100 mg肾组织，用剪刀剪碎；用PBS冲洗肾组织，放入4 ℃离心机，3 000 r・min-1离心5 min，反复冲洗，再离心，共3次；弃去PBS冲洗液，向肾组织中加入含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的总蛋白裂解液，用电动匀浆机匀浆，在冰上放置30 min，每隔3 min震荡1次，最后，再次放入4 ℃离心机，12 000 r・min-1离心30 min，取上清液（即总蛋白），少量用于BCA法测定蛋白浓度，其余按4∶1与蛋白上样缓冲液混匀，在沸水中煮10 min进行蛋白变性，于-80 ℃冰箱保存备用。提取总蛋白后，配制分离胶和浓缩胶，分别加样，在电泳槽中加满电泳缓冲液进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，PAGESDS）。电泳完毕，取下凝胶，根据目的蛋白的位置留取相应凝胶，并将凝胶上的蛋白电转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用含10%脱脂奶粉的Tris buffered saline tween（TBST）缓冲液[20 mmol・L-1 Tris HCl，150 mmol・L-1 NaCl，005%聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯（Tween 20）]封闭2 h。分别向PVDF膜中加入相应的一抗[SnoN（1∶800），TGFβ1（1∶1 000），pSmad2/3（1∶800），Smad7（1∶800），GAPDH（1∶1万）]，室温孵育4 h，用TBST缓冲液洗涤约1 h。分别加入二抗（HRP标记的山羊抗兔IgG抗体），室温孵育2 h，再次用TBST缓冲液洗涤约1 h。取出PVDF膜，将HRP显色液均匀地涂在PVDF膜上，在暗室曝光，定影。用Quantity one 411软件进行光密度分析，结果分别与GAPDH光密度相对照，其比值表示蛋白相对表达量。

235 统计学分析 实验数据采用±s表示。组间比较在进行方差齐性检验后采用单因素方差分析，P

3 结果

31 UCG对模型鼠一般情况、体重的影响

模型组和尿毒清组大鼠均出现明显的精神萎靡，活动度下降，食欲不振，轻度腹泻，毛发枯暗而杂乱等情况，其中，模型组大鼠最为明显，经UCG干预后，上述情况均有所改善。自术后（造模后0周）开始，模型组大鼠体重增长缓慢，经UCG干预后，体重有所上升，与模型组大鼠比较，其差异有统计学意义（P

32 UCG对模型鼠尿、血清生化指标的影响

在造模后第3周末，模型组、尿毒清组大鼠Upro，Scr，BUN，UA均有所升高，与正常组大鼠比较，其差异有统计学意义（P

33 UCG对模型鼠肾脏组织形态的影响

经光镜观察，正常组大鼠肾小球毛细血管襻开放良好，肾小管上皮细胞排列整齐，未见肾间质ECM增宽和明显的炎性细胞浸润（图1 A）；模型组大鼠肾小管上皮细胞排列紊乱，肾小管萎缩、塌陷，大量炎症细胞浸润，肾间质内ECM面积增多（图1 B），与正常组大鼠比较，其差异有统计学意义（P

34 UCG对肾组织pSmad2/3和Smad7蛋白表达的影响

在造模后第3周末，模型组大鼠肾组织pSmad2/3蛋白表达水平明显上调，与正常组大鼠比较，其差异有统计学意义（P

35 UCG对肾组织TGFβ1和SnoN蛋白表达的影响

在造模后第3周末，模型组大鼠肾组织TGFβ1蛋白表达水平明显上调，与正常组大鼠比较，其差异有统计学意义（P

4 讨论

腺嘌呤在体内通过黄嘌呤氧化酶的作用生成衰竭。腺嘌呤致病起于“炎症”，其最终的肾小管/间质病变特征与人类肾衰竭颇为相似[15]。然而，值得注意的是，腺嘌呤引起的肾功能减退是可逆的。笔者发现，如果腺嘌呤给药时间小于4周，肾小管/间质损伤和肾功能指标是可以自行恢复至正常水平的，这一点，与国外同类研究的结论相似[16]。为了模拟人类CRF的病变过程，笔者采用腺嘌呤灌胃联合UUO的方法而建立肾衰竭模型。结果显示，在造模后的第5周末，模型鼠肾脏肿大，苍白而缺血，肾盂高度扩张，肾皮质变薄；肾间质出现明显的纤维化病理特征，包括肾小管上皮细胞排列紊乱，肾间质出现明显的ECM增宽，ECM及胶原所占面积呈弥漫性增加，肾小管萎缩、塌陷，大量炎症细胞浸润等；肾功能指标也相应上升，其中，Scr达（13214±945）μmol・L-1，BUN达（2383±452） mmol・L-1，UA达（15414±1779） μmol・L-1。尽管模型鼠的造模时间不够长，但是，其典型的肾小管/间质病变特征和稳定的生化指标可以模拟人类早、中期阶段的CRF。因此，笔者认为，腺嘌呤灌胃联合UUO诱导的肾衰竭模型可以用于CRF药效和药理学研究。

临床上，反映肾脏排泄功能的经典指标是Scr，BUN以及UA。笔者发现，UCG给药3周后，肾衰竭模型鼠Scr，BUN和UA明显下降，同样，在肾脏组织形态特征方面，RIF的病理改变也得到相应的改善。这些结果再次印证了UCG是治疗CRF的有效药物。然而，UCG在体内是直接促进氮质代谢产物的排泄？还是作用于RIF的形成和发展而间接改善肾功能？迄今为止，其机制不是很清楚。笔者所属团队的前期研究表明，对于腺嘌呤灌胃联合UUO诱导的肾衰竭模型鼠，UCG在体内的作用靶点是调控ECM降解的关键酶――基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）[8]。尽管如此，UCG作为多成分的中药复方制剂，它对经典的TGFβ1/Smads信号通路中的关键信号分子――pSmad2/3和Smad7蛋白表达的调节作用也是不容忽略的。笔者发现，经UCG干预后，肾衰竭模型鼠肾组织TGFβ1和pSmad2/3蛋白表达下调，TGFβ1/Smad信号通路的信号转导途径被阻断；另一方面，UCG促进Smad7蛋白表达上调，而Smad7本身又是可以阻止Smad2和Smad3磷酸化的。因此，UCG调控TGFβ1/Smads信号通路而干预RIF是其间接改善肾功能的证据之一。值得注意的是，尽管UCG由10余种单味中药（大黄、黄芪、白术、茯苓、制何首乌、川芎、丹参、、姜半夏、甘草等）组成，而且，含有异黄酮、大黄素、黄芪甲苷、芍药苷、丹酚酸A等多种单体[7]，但是，Smads信号通路中的关键信号分子――pSmad2/3和Smad7都能呈双向性而受之影响，在不能使用体内特异性信号阻断剂加以佐证的前提下，笔者不禁想到，既然Smads信号通路的上游是有负性调控因子SnoN存在的，那么，UCG改善肾衰竭模型鼠RIF的作用是否与其有关呢？

研究表明[17]，原癌基因cski/sno编码的白SnoN是TGFβ1/Smads信号通路的负性调控因子，通过与Smads蛋白相互作用来抑制TGFβ1靶基因的转录，从而，负向调节TGFβ1/Smads信号通路的活性。据报道[18]，在UUO诱导的RIF模型中，TGFβ1的表达水平进行性增加，SnoN蛋白水平进行性减少，在造模后的第14天，SnoN减少了约90%，此时，模型鼠RIF最为严重。国内学者发现，对于相同的UUO大鼠模型，模型鼠出现肾小管萎缩，管腔扩张，肾间质大量胶原纤维沉积，肾间质明显增宽等典型的RIF病理特征；肾组织中TGFβ1含量显著增加，SnoN蛋白表达水平显著下调，而川芎嗪可以降低模型鼠肾组织中TGFβ1含量，恢复Smads负性调控因子SnoN蛋白表达水平[19]。笔者的研究结果显示，在腺嘌呤灌胃联合UUO诱导的肾衰竭模型中，TGFβ1与SnoN的蛋白表达水平的确呈反向变化，pSmad2/3和Smad7的表达水平也有随之明显变化，这种变化与模型鼠肾组织RIF有紧密联系；UCG在体内反向调节了模型鼠肾组织TGFβ1和SnoN蛋白表达水平，其下游的pSmad2/3蛋白表达水平也得到相应的改善。因此，笔者有理由相信，UCG可能在体内多靶点地干预了TGFβ1，SnoN，pSmad2/3以及Smad7等关键信号分子表达而负向调节TGFβ1/Smads信号通路的活性。

总之，UCG可能在体内多靶点地调控TGFβ1/SnoN/Smad信号通路，从而减少ECM合成，延缓肾衰竭进展。当然，对于腺嘌呤灌胃联合UUO诱导的肾衰竭模型，笔者只是发现UCG的作用和机制与TGFβ1/SnoN/Smad信号通路有关，但是，其治疗靶点究竟是哪些信号分子，其调节机制是影响信号分子本身的活性，还是干预信号分子之间的结合？这些问题还没有明确答案。

[致谢] 本课题得到南京大学医学院附属鼓楼医院检验科罗浔阳副主任技师和科技处张乐助理研究员的帮助和指导。

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