冬虫夏草人工培殖过程中寄主昆虫粉拟青霉病原菌的分子生物学研究

[摘要]虫草棒束孢Isaria farinosa是冬虫夏草人工培殖过程中寄主昆虫粉拟青霉病的病原菌。该文通过统计分析国内外相关文献和NCBI网站上登录的相关序列和基因信息，分析虫草棒束孢的分子生物学研究进展。结果发现不同国家发表的文献不同，登录的相关序列或基因的种类和数量存在差异。我国发表的文献和登录的序列或基因总量都最多，美国登录的功能基因总量最多。相关文献主要涉及粉拟青霉病在生物防治方面的应用。而与分子生物学相关的研究主要集中在该菌的系统分类学上；近年来开始了与虫草棒束孢作为生防菌相关的蛋白酶基因和几丁质酶基因等的研究。随着冬虫夏草在健康领域影响力的增强，以及虫草棒束孢全基因组序列的测序完成和药理活性的不断揭示，对虫草棒束孢分子水平的研究也必将越来越广泛和深入。

[关键词]虫草棒束孢；冬虫夏草菌寄主昆虫；冬虫夏草菌；分子生物学

[Abstract]Isaria farinosa is the pathogen of the host of Ophiocordyceps sinensis. The present research has analyzed the progress on the molecular biology according to the bibliometrics， the sequences （including the gene sequences） of I. farinosa in the NCBI. The results indicated that different country had published different number of the papers， and had landed different kinds and different number of the sequences （including the gene sequences）. China had published the most number of the papers， and had landed the most number of the sequences （including the gene sequences）. America had landed the most numbers of the function genes. The main content about the pathogen study was focus on the biological controlling. The main content about the molecular study concentrated on the phylogenies classification. In recent years some protease genes and chitinase genes had been researched. With the increase of the effect on the healthy of O. sinensis， and the whole sequence and more and more pharmacological activities of I. farinosa being made known to the public， the study on the molecular biology of the I. farinosa would be deeper and wider.

[Key words]Isaria farinosa； host of Ophiocordyceps sinensis； Ophiocordyceps sinensis； molecular biology

doi：10.4268/cjcmm20160307

在发现虫草棒束孢Isaria farinosa是冬虫夏草菌寄主昆虫粉拟青霉病的病原菌之前，虫草棒束孢就已经是一种有效的生防真菌，在农业和林业害虫的防治方面运用较多，因此一直以来关于其作为生防菌的特性研究就连续不断。如优质菌种资源的采集[1-2]；孢子及其菌丝生长发育的温度、湿度等条件的研究[3-5]；寄主范围、毒力及致病机制的研究等[6-7]。然而随着长期的使用，人们发现病原微生物或有害昆虫也对虫草棒束孢产生了抗性，并且在使用过程中虫草棒束孢菌株的致病性在减弱[8]。然而与此相反的是，在名贵中药冬虫夏草的人工培殖过程中发现的虫草棒束孢却成了寄主昆虫的高致死病原菌，并且在多年的实践过程中发现其病害发生呈现增强之势。一方面是生防菌株毒力的减弱，另一方面是冬虫夏草菌寄主昆虫拟青霉病害的严重性逐渐增强，因此深入系统研究虫草棒束孢菌株之间的差异，特别是其毒力分化的分子机制就显得尤为重要。为此，本文从文献计量学及相关研究内容的角度系统研究了国内外对虫草棒束孢分子生物学的研究进展，以期为进一步开发利用虫草棒束孢、筛选菌株毒力基因和有针对性地构建高效防治冬虫夏草寄主昆虫粉拟青霉病害的超级菌株提供基础。

1材料与方法

分别在Google学术和 Web of Science网站上输入关键词“Isaria farinosa”或“Paecilomyces farinosus”，检索时间截止为2015年4月30日。对检索出的文献通过题名和摘要提供的信息再一次确定其是否属于本检索范围或是否与本检索内容相关，并对每篇相关文献的研究领域归类统计和分析。在NCBI网站上输入关键词“Isaria farinosa”或“Paecilomyces farinosus”，对检索到的碱基序列（包括基因序列）信息进行归类统计。

2结果

2.1发表年度与文献数量的关系通过检索和核实，最终有419篇文献属于该检索范围或与该检索范围相关。最早发表关于虫草棒束孢的文献是1894年，这与Zimmermann G[9]认为是1832年存在差异，之后近30年的时间内几乎就没有相关文献发表。从1927年到1954年约25年的时间内，偶尔有相关的文献发表。从1955年到1985年约30年的时间相关文献的发表一直保持在低位水平。从1986年开始，相关的文献发表量开始逐年增加。2005年之后，文献增加量较为明显，至2008年相关文献量增加到两位数，到2014年增加到有记录以来40篇文献的最高纪录。以年度为自变量X，文献发表数量为依变量Y，对数据进行回归分析，回归方程为Y=0.155 4X-301.09，结果发现两者之间不存在显著的线性回归关系，表明未来几年内关于虫草棒束孢的文献数量不会呈线性增加，见图1。

2.2不同国家发表的文献数量统计显示共有61个国家发表过相关的文献。相关文献发表数量居前20位的国家见图2。其中中国发表的文献数量最多为97篇，其次是美国为35篇，日本发表27篇文献位居第3。加拿大及其以后的国家发表的文献都在20篇以下。这一结果表明不同国家对虫草棒束孢关注程度的差异。

2.3不同研究方向所涉及的文献数量以发表文献所涉及的研究领域为统计标准，将不同的文献分别归类到生物防治（biological control）、生物学特性（biological characteristic）、分布（distribution）等15个类别中。发表文献相对较多的前8个方面的研究领域，其中对虫草棒束孢生物防治方面的文献数量最多为135篇，其次是生物学特性的研究为95篇，关于分布方面的文献位列第3。关于虫草棒束孢分子生物学特性方面的文献为31篇，位列第4。这一结果表明国内外对虫草棒束孢不同领域关注程度的差异，见图3。

2.4不同国家在NCBI登录的序列数量在对检索到的181条碱基序列中，以不同的国家为横坐标，以各个国家在NCBI登录的序列数量为纵坐标作图，见图4。迄今为止，有20个国家研究过该菌的相关序列，地理分布于亚洲有6个国家，欧洲有10个国家，美洲有4个国家，大洋洲和非洲没有国家登录过该菌的相关序列。在所有研究的国家中，中国登录的序列数量最多为47条，其次是美国为36条，日本登录的基因序列数量为16条，排列第3。这一结果表明不同国家对虫草棒束孢碱基序列关注程度的差异。

2.5不同年度登录的序列数量以年度为横坐标，以各年在NCBI登录的序列数量为纵坐标作图。2000年，韩国最早将该菌碱基序列登录NCBI，其登录号是AF237664，是关于该菌ITS1+5.8S+ITS2+28S片断的碱基序列。从此以后，除2001年和2005年没有该菌相关序列的登录外，每年都有对该菌相关序列的登录。以年度为自变量X，碱基序列登录数量为依变量Y，对数据进行回归分析，回归方程为Y=0.155 4X-301.09，结果发现两者之间不存在显著的线性回归关系。表明未来一段时间内，登录碱基序列的数量不会呈线性增加，见图5。

2.6不同序列登录的数量与该菌登录序列总量的比值以在NCBI登录的序列名称为横坐标，以各序列的总量与该菌所有已登录序列总量的比值为纵坐标作图，见图6。登录18S+ITS1+5.8S+ITS2+28S序列的数量最多，其次是登录功能基因的数量，关于18S+ITS1+5.8S，18S+ITS1，5.8S+ITS2，ITS2+28S，5.8S 和ITS2的序列信息没有登录。这一结果表明国内外对该菌不同序列关注程度的差异。

2.7同一序列登录的国家数量与登录国家总数量的比值以在NCBI登录的序列名称为横坐标，以登录该序列的国家数量与所有已登录的国家总数量的比值为纵坐标作图，见图7。登录18S+ITS1+5.8S+ITS2+28S序列的国家数量最多，其次是登录功能基因的国家数量。没有国家登录18S+ITS1+5.8S，18S+ITS1，5.8S+ITS2，ITS2+28S，5.8S 和ITS2的序列信息。这一结果表明不同序列受关注程度的差异。

2.8不同国家登录18S+ITS1+5.8S+ITS2+28S序列的数量以在NCBI登录数量最多的18S+ITS1+5.8S+ITS2+28S序列为对象，研究不同国家的登录数量。以国家名称为横坐标，登录的该序列数量为纵坐标作图，见图8。中国登录该序列的数量最多为27条，其次是丹麦，日本登录的数量位居第3。这一结果表明不同国家对18S+ITS1+5.8S+ITS2+28S序列关注程度的差异。

到目前，虫草棒束孢的分子生物学研究主要集中在分类问题上。Obornik等[10]和Luangsa-ard等[11]分别基于rRNA和rDNA特征鉴定了拟青霉属并发现该属内物种具有多源性。Luangsa-ard等[12]采用β-tubulin基因和ITS序列同样证明了拟青霉属内物种系统发育的多源性，同时发现一个无性型种群并定义了棒束孢属，其中包括虫草棒束孢。Inglis和Tigano[13]通过用5.8S rDNA，ITS1和ITS2的种内系统发育分析结果也支持棒束孢属的定义。Gams等[14]、Hodge等[15]和Sung等[16]的研究结果也证明了粉拟青霉更名为虫草棒束孢的合理性。在国内，黄勃等[17-18]对主要来自安徽省不同区域的虫草棒束孢进行了RAPD聚类树状图分析，与基于ITS构建的分子系统发育相比，结果表明RAPD聚类树状图不适于分析虫草棒束孢种间亲缘关系。2003年，黄勃[19]又对同一批虫草棒束孢的种内ITS进行了分析，并发现单起源的棒束孢属内菌株的ITS序列具有多态性，源于同一地区菌株的ITS变异也较大。同时还证明，虫草棒束孢菌株间的差异与地理来源及寄主均无相关性。韩燕峰[20]在表型特征的基础上采用ITS序列鉴定了中国部分未知的棒束孢菌株，并采用分子系统发育树证明了棒束孢新种的存在，同时采用ITS1-5.8S-ITS2较好的证明了中国棒束孢属内种性的多样性。

2.9不同I. farinosa菌株18S+ITS1+5.8S+ITS2+28S序列的系统进化距离以近源种为参照，以在NCBI上登录的该菌所有18S+ITS1+5.8S+ITS2+28S序列为对象分析该菌的分子系统发育见图9。从图中可发现，同属的JX12226.1菌株单独形成一个A分支，说明18S+ITS1+5.8S+ITS2+28S序列在该物种中与其他的近源种中的差别相对更明显。在B分支中又分为a和b 2个子分支，其中I. farinosa的序列全被分到了子分支b中，并且分别聚为Ⅰ和Ⅱ 2个小分支。这一结果说明18S+ITS1+5.8S+ITS2+28S序列在该物种的分类中可以作为一个较好的参考依据。由于该序列普遍存在于真菌中，且不具有较强的保守性，因此常被作为分类的参考依据。

2.10不同国家登录功能基因的数量以在NCBI登录的功能基因序列为对象，研究不同的国家对功能基因登录的数量。以国家名称为横坐标，以各个国家登录的功能基因数量为纵坐标作图，见图10。美国对功能基因登录的数量最多为15条，其次是中国为13条，泰国对该菌功能基因登录的数量位列第3。这一结果表明不同国家对功能基因关注程度的差异。

2.11不同功能基因登录的数量以在NCBI已登录的功能基因为对象，研究不同的功能基因登录的数量。以不同功能基因名称为横坐标，以该基因登录的数量为纵坐标作图，见图11。对TUB基因登录的数量最多为12条，其次是TEF基因，RPB基因登录的数量为8条，位居第3。这一结果表明国内外对虫草棒束孢功能基因关注程度的差异。

2.12不同I. farinosa菌株TUB基因序列系统进化距离以近缘种的TUB基因序列为参照，以在NCBI上登录的I. farinosa所有TUB基因序列为对象分析该菌系统发育，见图12。发现该基因可以分为Ⅰ和Ⅱ 2个较大的分支。但I. farinosa的TUB基因在2个分支中都有分布，不能明显地与其他近源种区别开。这一现象说明TUB基因序列在I. farinosa及所研究的其他近源物种中相对保守。TUB基因是杀菌剂的抗性基因[21]，在病原微生物中最终翻译成微管蛋白[22]。而微管蛋白是微管的基本组成单位，微管在细胞形状、运动、胞内物质运输中起到重要的作用，而这些功能是在该类微生物中普遍存在的，这就要求该功能必须保持稳定才能保证生物体的正常功能。I. farinosa菌株TUB基因的进化距离结果再一次证明了该功能的稳定性。由于TUB基因较为稳定，所以在分子生物学的研究中常作为内参基因，而不能作为分类的依据。

正确的物种鉴定及其种属关系是进一步开发利用该物种的前提。目前，虫草棒束孢的分类地位已经明确，这为进一步研究虫草棒束孢分子生物学特性奠定了基础。然而，虫草棒束孢进一步的分子研究刚刚起步，并且仅局限在作为生防菌的角度进行的。2002年，黄勃等[23]对虫草棒束孢rRNA基因内转录间区（ITS）和5.8SrRNA基因进行了克隆和测序。2006年，黄勃等[24]采用RT-PCR和3′/5′-RACE相结合的方法，首次从虫草棒束孢中克隆出完整的类枯草杆菌蛋白酶cDNA基因并对基因序列和蛋白质进行了分析。同年，黄勃等[25]通过设计基因保守区的特异性简并引物，运用SMARTRACERT-PCR技术，首次从虫草棒束孢中克隆出完整的几丁质酶基因，并对其结构进行了分析。2010年，庄宗兰等[26]运用PCR技术与DNA步移技术，从虫草棒束孢中克隆出类枯草杆菌蛋白酶的结构基因及其上游序列。同年，Singkaravanit等[27]比较了虫草棒束孢和其他4种虫生真菌的GGPP酶的氨基酸序列差异，并发现虫草棒束孢含有ggs1型GGPP酶基因。2014年，印度的Agrawal等[28]采用全基因组鸟枪法（Whole Genome Shotgun WGS）完成了该菌MTCC 4114菌株全基因组序列分析，基因组大小为34.16 Mb，获得1 314条Scaffolds序列。

3讨论

综上可见，虫草棒束孢的分子生物学特性研究较少。这也反映出国内外学者对虫草棒束孢的重视不够。因此该菌的研究具有广阔的空间。特别是近年来冬虫夏草在健康领越的影响力不断增强，作为其人工培殖过程中的病原菌，虫草棒束孢在致病性方面的研究必将受到重视。而人们进一步发现虫草棒束孢次生代谢产物中的生物碱类[29]、多糖类[30]、酮类[31]、醌类物质[32]等成分显示出抗衰老、抗肿瘤等功效，因此，对虫草棒束孢的研究意义就显得更加明显。随着虫草棒束孢全基因组序列的测序完成，对该菌分子水平的研究将会更加广泛和深入。基于此，作者建议从以下2个方面开展研究：继续从分子水平研究虫草棒束孢的生防机制。有利于实现超级生防菌株的构建，对有效防治冬虫夏草寄主昆虫的拟青霉病害有重要意义。虫草棒束孢的次生代谢产物显示出多种显著的活性。有必要在全面、系统研究活性代谢产物的基础上深入开展虫草棒束孢药理活性与基因功能之间的关系，以便构建特定活性成分的超级生产菌株。

[致谢]中国农业大学张国珍教授对文章提出宝贵意见。

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