大黄中药材及其醇、水提取物中大黄素成分分析标准物质研究

[摘要]采用“单一化学成分复杂成分体系”的量值传递技术路线，完成了大黄、大黄95%乙醇提取物、大黄水提取物中大黄素成分分析系列标准物质的研制。使用大黄素国家一级纯度标准物质进行量值传递，利用高效液相色谱协作标定法，确定了不同基质中大黄素成分的标准值；建立不确定度评估数学模型并计算各不确定度分量，最终获得不确定度值。完成大黄、大黄95%乙醇提取物、大黄水提取物中大黄素成分分析标准物质，其大黄素成分分别为0.40%±0.03%，1.15%±0.18%，0.16%±0.08%（k=2，P=0.95）。建立的量值传递技术路线成功解决了中药复杂体系中化学成分量值溯源的技术难题，研制的标准物质属国家级计量有证标准物质，为大黄中药材及其提取物中大黄素的定量质量控制提供了准确可靠的标准物质、物质标准、标准方法。

[关键词]大黄；大黄95%乙醇提取物；大黄水提取物；大黄素；标准物质；不确定度

[Abstract]The certified reference materials （CRMs） of emodin in rhubarb and its alcohol extract， water extract were developed by using quantity transfer technology from single chemical composition to the complex systems. The CRM of emodin was used for quantity transfer， and high performance liquid chromatography （HPLC） method was used to determine the contents of emodin in different matrix composition. By establishing mathematical model and calculating the parts of uncertainty， the uncertainty values were finally gotten. CRMs of emodin in rhubarb， alcohol extract and water extract were accomplished. The content values of emodin were 0.40% ±0.03%， 1.15%±0.18%， 0.16%±0.08% （k=2，P=0.95）， respectively. The established method for quantity transfer has successfully solved the technical problems that the value of active ingredient of traditional Chinese medicine can′t be traced to SI units. The series of CRMs are assigned as grade primary reference materials， which are useful for quality control of the emodin content， also provide the accurate and reliable CRM， materials standard and standard methods.

[Key words]rhubarb； alcohol extract； water extract； emodin； CRM； uncertainty

中药历史悠久，其用药特点是多成分复杂体系协同起效，因此如何进行中药的质量控制成为研究重点与难点，这也成为了制约中药国际化与现代化进程的主要原因。在中药的质量控制中，有效成分含量的控制是关键，用于含量测定的中药对照品的标准化则成为关键中的关键[1-2]。通常情况下，有效成分在中药材中的含量较低，通过水煎、醇提等提取方式可以实现有效成分的富集，但有效成分在水提取物和醇提取物中的含量差异显著。因此对于不同中药产品的质量控制，若均以有效成分的化学纯品进行参照，难免由于含量值数量级的差异而引起较大测量误差与基体误差。

国际对药品质量控制趋势已从仅提供药物的有效成分含量值，发展到需要提供药物有效成分的标准值和不确定度值，即将药品的一般标准提升为计量标准，以保证药品质量控制的量值溯源性和准确性[3]。因此，能够符合国际计量标准并能用于国际交流的中药材相关标准物质将成为中药质量控制的趋势所向。

本文首次完成了大黄、大黄95%乙醇提取物、大黄水提取物中大黄素成分分析国家级标准物质的研制，确定了药材、醇提物、水提物3种不同基质中大黄素成分含量的标准值与不确定度值。大黄不同基质中有效成分含量的系列标准物质研制，使相关中药药品检测更加便捷、准确、可靠，同时也为中药标准品的标准化探索提供了可借鉴的数据与经验。

1材料

高效液相色谱仪：美国Agilent 1200型，DAD检测器，Agilent chemstation工作站；分析用天平：XS105型，Mettler，感量0.01 mg （0≤m≤5 g，0.01mg；5≤m≤20 g，0.02 mg）；三用电热恒温水箱：SHH.W21.420，北京精科华瑞仪器有限公司。

国家一级标准物质：大黄素化学纯度标准物质，证书编号GBW09513，纯度标准值及不确定度值：99.54%±0.18%（k=2，P=0.95）[5]（经中国医学科学院药物研究所研制）。

大黄中药材，甘肃产（经中国医学科学院药物研究所马林教授鉴定）样品，质量检查符合2010年版《中国药典》规定要求[6]。大黄中药材经除尘、粉碎、并过50目筛，备用。精密称取1 g样品置于棕色安瓿瓶密封包装，共计完成了500支最小包装1 g量的大黄中药材成分分析标准物质候选物样品的制备工作。

大黄醇提取物，取大黄中药材，以5倍量95%乙醇作为提取溶剂，经加热回流提取3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏，浸膏真空干燥，粉碎过40目筛，再经温度70 ℃，压力-0.09 MPa下真空干燥，得大黄95%乙醇提取物，备用。精密称取100 mg样品置于棕色安瓿瓶密封包装，共计完成了500支最小包装100 mg量的大黄95%乙醇提取物成分分析标准物质候选物样品的制备工作。

大黄水提取物，取大黄中药材，粉碎，加入6倍量纯净水，煎煮1 h，过滤，得提取液，将药渣再加入与提取液等体积的纯净水，煎煮1 h，过滤，再次向药渣中加入与提取液等体积纯净水，继续煎煮1 h，过滤。合并上述3次提取液，水浴挥干后，75 ℃真空干燥，得大黄水提取物，备用。精密称取100 mg样品置于棕色安瓿瓶密封包装，共计完成了500支最小包装100 mg量的大黄水提取物成分分析标准物质候选物样品的制备工作。

甲醇（Fisher Chemical，色谱纯）；磷酸（分析纯，北京化学试剂公司）；娃哈哈饮用纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2方法与结果

2.1高效液相色谱法

2.1.1色谱条件[7-8]Agilent SB C18色谱柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流动相甲醇-0.1%磷酸 80∶20；流速1.0 mL・min-1；柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长254 nm。

2.1.2溶液制备方法标准储备液制备方法：精密称取大黄素化学纯度标准物质11.08 mg，置于50 mL量瓶中，用色谱级甲醇将样品完全溶解，并定容至刻度，摇匀，配制成大黄素为220.6 mg・L-1的标准储备液。精密移取0.1， 0.5， 1.0， 2.5， 5.0， 10.0 mL分别置于10 mL量瓶中，用色谱级甲醇稀释至刻度，获大黄素为2.2， 11.0， 22.1， 55.2， 110.3， 220.6 mg・L-1的标准溶液。

精密称取大黄中大黄素成分分析标准物质样品150 mg、大黄95%乙醇提取物中大黄素成分分析标准物质样品30 mg、大黄水提取物中大黄素成分分析标准物质样品30 mg，分别置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25 mL（水提取物为20 mL），称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 mL（水提取物为10 mL），置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10 mL，超声处理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀滤过，取续滤液，即得。

2.2方法学考察

2.2.1线性关系考察分别精密移取6种不同浓度分标准溶液10 μL注入到液相色谱仪，记录色谱图及峰面积。色谱峰面积分别55.65， 279.07， 564.76， 1 387.77， 2 768.12， 5 371.02，以峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，获得回归方程为Y=24.365X+26.858，相关系数r为0.999 9（n=6）。标准曲线实验结果表明，大黄素标准溶液在2.2～220.6 mg・L-1线性关系良好。

2.2.2仪器精密度精密吸取浓度为220.6 mg・L-1的大黄素标准储备液1mL至10 mL量瓶，用色谱甲醇稀释至刻度。采用高效液相色谱法，按照2.1.1项下色谱条件，重复测定6次，记录色谱图，获得大黄素的峰面积为564.25， 564.87， 566.85， 568.46， 567.96， 567.08，计算RSD为0.30%，表明仪器精密度良好。

2.2.3方法精密度精密吸取浓度为220.6 mg・L-1的大黄素标准储备液1 mL置于10 mL量瓶，6份，用色谱甲醇稀释至刻度，采用高效液相色谱法，按照2.1.1项下色谱条件，各重复进样3次，分别记录色谱图，获得大黄素的色谱面积均值为560.35，557.10，568.95，566.63，564.17，560.70，计算RSD为0.61%，表明实验方法精密度良好。

2.2.4标准物质溶液制备方法的精密度分别称取大黄中药材、大黄95%乙醇提取物、大黄水提取物样品各6份，按照2.1.2项下的溶液制备方法，按照2.1.1项下色谱条件进行测定。大黄中大黄素成质量分数为0.391%，0.385%，0.403%，0.397%，0.395%，0.402%，平均为0.395%，RSD为1.7%；大黄95%乙醇提取物中大黄素成分质量分数为1.133%，1.150%，1.166%，1.154%，1.130%，1.157%，平均为1.148%，RSD为1.2%；大黄水提取物中大黄素成分质量分数为为0.154%，0.156%，0.159%，0.153%，0.159%，0.159%，平均为0.156%，RSD为1.7%；表明大黄中药材、大黄95%乙醇提取物、大黄水提取物系列标准物质溶液制备方法的重现性良好。

2.2.5标准物质溶液的回收率试验分别称取大黄中药材150 mg、大黄95%乙醇提取物30 mg、大黄水提取物样品30 mg各6份，分别加入大黄素纯度标准物质作为加标样品，其中大黄素纯度标准物质按化学纯度99.54%计。按照2.1.2项下的标准物质溶液制备方法制备样品，采用高效液相色谱法测定大黄素含量，计算回收率。大黄中大黄素回收率为98.79%，96.61%，99.02%，100.3%，100.1%，102.3%，平均回收率为99.52%，RSD为1.9%；大黄95%乙醇提取物中大黄素回收率为97.66%，99.71%，99.76%，98.77%，98.64%，99.94%，平均回收率为99.08%，RSD为0.89%；大黄水提取物中大黄素成分含量的回收率为97.45%， 98.25%，101.5%，96.86%，98.57%，100.8%，平均回收率为98.90%，RSD为1.9%，结果表明建立的系列标准物质中大黄素成分含量测定方法具有较好的准确性。

2.3均匀性试验

从500支标准物质候选物中随机抽取15瓶样品，每瓶样品平行取样3份，均按照2.1.2项下的溶液制备方法，按照2.1.1项下色谱条件测定大黄素成分含量，共分别获得45个均匀性检验数据。大黄中药材、大黄95%乙醇提取物、大黄水提取物的均匀性数据，见表1。

采用单因素方差分析（One Way Anova）[9]对均匀性数据进行组内和组间的统计分析，计算各自的自由度N1（组间）和N2（组内）。查F分布表中相应N1，N2，α（显著性水平）所对应的F临界值，并与计算获得的统计量F进行比较，若统计量F小于临界值F，则瓶―瓶之间样品非均匀引入的离散性与测量方法引入的离散性相比，可以忽略不计，就认为样品是均匀的。反之就是不均匀的。

测定大黄中药材、大黄95%乙醇提取物、大黄水提取物中大黄素含量得F分别为1.75，1.14，0.94；均小于临界值[F0.05（14，30）=2.04]，即，F

2.4长期稳定性试验

对密封包装后的标准物质候选物样品放置在常温条件下长期保存，考察样品的稳定性，并分别于0，1，2，4，6，12月随机抽样，每个点随机抽样6瓶照2.1.2项下标准物质溶液制备方法，按照2.1.1项下色谱条件测定大黄素成分含量，以X代表时间，以Y代表成分含量值。试验测定结果见表2。分别拟合2种化学成分的直线，获得直线方程，计算斜率的不确定度[8-9]，结果分别为：

大黄中大黄素：Y=-0.000 001X + 0.004，S（a）=s∑ni=1（Xi-X）2=2.87×10-6；

大黄95%乙醇提取物中大黄素：Y=0.000 001X+ 0.011 4，S（a）=s∑ni=1（Xi-X）2=1.03×10-5；

大黄水提取物中大黄素：Y=0.000 005X + 0.001 6，S（a）=s∑ni=1（Xi-X）2=6.26×10-6

三者自由度均为：n -2 = 6-2 = 4和P=0.95（95%置信区间）的t因子等于2.776，由于大黄素含量测定值|a|

2.5成分含量标准值定值

依据国家一级标准物质技术规范，本文采用6家实验室联合定值方法对大黄、大黄95%乙醇提取物、大黄水提取物中大黄素成分进行定值，定值数据见表3。

采用格拉布斯检验，剔除可疑值，并采用科克伦（Cochran）等精度检验，证明大黄素成分含量的测量数据均属等精度数据。计算获得6家联合定值的中药材大黄中大黄素成分含量标准值P=0.403%，S=0.000 227；大黄95%乙醇提取物中大黄素成分含量标准值P=1.151%，S=0.000 273；大黄水提取物中大黄素成分含量标准值P=0.159%，S=0.000 08。

2.6不确定度评定

2.6.1成分含量标准值的不确定度评估大黄、大黄95%乙醇提取物、大黄水提取物中大黄素成分分析标准物质的总不确定度由3个部分组成：第一部分是测量标准值引入的不确定度；第二部分是由样品不均匀性引入的不确定度；第三部分是由样品稳定性引入的不确定度。其中，测量标准值引入的不确定度包含国家一级标准物质引入的不确定度、中药材及其提取物中有效成分提取及含量测定过程引入的不确定度以及联合定值的标准曲线拟合引入的不确定度等方面。

2.6.2标准值的不确定度计算国家一级标准物质引入的不确定度值urelP。大黄素纯度标准物质的量值为99.54%±0.18%，其标准不确定度值为0.18%/2 = 0.09%，相对标准不确定度值为urelP=0.09%/99.54%=0.000 904。

测量数据的不确定度值urelj。数学模型考虑到使用标准曲线测量方法、高效液相峰面积值影响因素而建立。大黄、大黄95%乙醇提取物、大黄水提取物中大黄素成分分析标准物质中大黄素成分含量。

x=（A测-b）×Vx1×Vx3a×m2×Vx2×100%

根据JJF1059-1999 [10]及建立的数学模型，提取及测定过程引入的不确定度评定结果见表4。

联合定值的标准曲线拟合引入的不确定度值urelf。按照指南35 [11]规定，标准曲线拟合的标准偏差计算公式为。

urelf=uc1/c1， 其中

uc1=SAa1m+1n+c1-c02∑ni=1ci-c02

SA=∑ni=1Ai-aci+b2n-2

S（A） ：标准溶液峰面积的标准偏差；m中药材大黄、95%乙醇提取物、水提取物溶液的测定次数；n标准溶液的总测定次数；C0标准溶液（μg・mL-1）；C1中药材大黄、95%乙醇提取物、水提取物溶液（mg・L-1）；i校准溶液的第n次测量。以x代表检测样品的溶液浓度，以y代表检测样品的峰面积，分别拟合标准曲线而获得直线。联合标定单位的标准曲线相对不确定度urel（f）值结果见表5。

按urel=∑ni=1（ureli）2计算获得6家单位标准曲线的不确定度分别为：大黄中大黄素成分分含量标准曲线的不确定度urel（f）=0.027 4。

大黄95%乙醇提取物中大黄素成分分含量标准曲线的不确定度urel（f）=0.076 4。

大黄水提取物中大黄素成分分含量标准曲线的不确定度urel（f）=0.223 1。

合成标准不确定度计算，按照uc（x）=x×urelP2+urelj2+urelf2分别计算大黄、大黄95%乙醇提取物、大黄水提取物中大黄素成分分析标准物质的合成标准不确定度值为0.000 115，0.000 880，0.000 355。

2.6.3样品均匀性引入的不确定度urelSH按照国际标准化组织标准物质指南35规定，由均匀性产生的不确定度计算。

当F=MS组间MS组内大于1时，urelSH=1nMS组间-MS组内；

当F=MS组间MS组内小于1时，urelSH=MS组内n×2v组内。

式中urelSH表示均匀性产生的不确定度，n表示测定次数，MS组间表示组间均方差，MS组内表示组内均方差。大黄、大黄95%乙醇提取物、大黄水提取物中大黄素成分分析标准物质由均匀性产生的不确定度分别为0.000 040 6，0.000 966，0.000 036 4。

2.6.4样品稳定性引入的不确定度urelSt稳定性引入的不确定度计算。

St=t・S（a） ；S（a）=S∑ni=1（Xi-X）2

式中S（a）表示斜率产生的不确定度，S表示直线的标准偏差，Xi表示时间点，X-表示时间均值，St表示稳定性产生的不确定度，t表示时间。大黄、大黄95%乙醇提取物、大黄水提取物中大黄素成分分析标准物质由稳定性产生的不确定度值分别为0.000 034 4， 0.000 123， 0.000 075 1。

2.6.5总合成标准不确定度按照uc（总）=ucx2+urelSH2+urelSt2计算，大黄、大黄95%乙醇提取物、大黄水提取物中大黄素成分分析标准物质的总合成不确定度分别为0.000 126 7，0.000 894，0.000 365。

2.6.6扩展不确定度由总合成不确定度计算扩展不确定度（U），扩展因子k=2，大黄、大黄95%乙醇提取物、大黄水提取物中大黄素成分分析标准物质的扩展不确定度分别为0.000 254， 0.001 79， 0.000 73。

2.7成分含量标准值及不确定度表示

在测量不确定度的最终计算中，一般采用只进不舍的规则。故中药材大黄中，大黄中大黄素成分分析标准物质定值结果：0.40%±0.03%，k=2，P=0.95；大黄95%乙醇提取物中大黄素成分分析标准物质定值结果1.15%±0.18%，k=2，P=0.95；大黄水提取物中大黄素成分分析标准物质定值结果0.16%±0.08%，k=2，P=0.95。

3讨论

本论文采用“单一化学成分（有效或标识化学成分）复杂成分体系（中药材及其提取物）”的量值传递技术路线，成功研制了大黄中大黄素成分分析标准物质GBW（E）090308、大黄95%乙醇提取物中大黄素成分分析标准物质GBW（E）090341、大黄水提取物中大黄素成分分析标准物质GBW（E）090328，解决了中药材及其提取物等复杂体系中的相关化学成分的量值溯源性科学技术难题。

本文研制的大黄及其提取物中大黄素成分分析系列标准物质均含有准确的量值与不确定度，属国家二级计量有证标准物质，具量值溯源和量值传递功能，可用于国际交流，为推动中药的标准化、现代化与国际化，提供了准确可靠的标准物质、物质标准、标准方法。

中药材有证国家级标准物质研究在我国刚刚起步，本论文研制的系列标准物质在我国尚属首次，填补了标准物质领域的品种空白，同时为中药相同类型标准物质的研制起到了一定的指导和示范作用。

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[11]International Organization for Standardization. ISO Guide 35， Reference materials-General and statistical principles for certification[S].2006.