福建汉族人胰岛素样生长因子受体基因福建汉族人胰岛素样生长因子受体基因

[摘要] 目的：探讨胰岛素样生长因子受体（IGF-1R）基因多态性与福建汉族人非小细胞肺癌（NSCLC）易感性的关系。方法：应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和DNA测序方法检测福建籍汉族NSCLC患者260例和健康人258例的IGF-1R+1013和IGF-2R+1619两个位点的等位基因分布，探讨不同基因型与NSCLC发病的关系。结果：IGF-1R+1013（G/A）基因型和各等位基因的频率在两组中分布有显著性差异（P < 0.05），与GG基因型者相比，GA、AA基因型者NSCLC患病风险均显著增加（P < 0.05），未发现IGF-2R+1619（G/A）位点各基因型和等位基因的频率分布在两组中的差异有统计学意义（P > 0.05）。根据病理类型分层分析发现，IGF-1R+1013（G/A）变异等位基因A携带者（GA+AA）患肺鳞癌、腺癌、其他类型肺癌的风险增加2.20倍、0.55倍、0.96倍（P < 0.05）。未发现IGF-1R+1013、IGF-2R+1619两基因多态性与临床分期、淋巴结转移、远处转移有关（P＞0.05）。两基因多态性的联合分析显示，同时携带IGF-1R+1013（G/A）和IGF-2R+1619（G/A）A等位基因者NSCLC的患病风险增加（P = 0.003）。结论：IGF-1R+1013（G/A）中，变异等位基因A是肺癌发生的危险因素，IGF-1R+1013（G/A）和IGF-2R+1619（G/A）基因多态性对肺癌的易感性有协同作用。

[关键词] IGF-1R IGF-2R 基因多态性 非小细胞肺癌

目前，肺癌已成为发病率、死亡率最高的恶性肿瘤之一 [1]。IGF-1R+1013（G/A）和IGF-2R+1619（G/A）是目前研究最多的且与肿瘤发生密切相关的两个单核苷酸多态性(SNP)位点[2]，但迄今在中国人群中，该两位点基因多态性未见报道。本文分析了福建地区汉族人群这两个位点的单核苷酸多态性，以探讨其与NSCLC发病的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。肺癌血清标本来自于2010年10月～2011年6月经病理确诊的260例NSCLC患者，其中男性173例，女性87例，男女比例约2 : 1，年龄范围35～93岁，平均年龄61.1岁；258例自愿参加的健康人群血清作为对照组，其中男性171例，女性87例，年龄范围为39～90岁，平均年龄58.24岁，两组性别、年龄无统计学差异。纳入标准: ①每份样品均为3代以内无异族通婚史且无亲缘关系的血液标本，并与受检者签署知情同意书。②对照组均无其他部位原发肿瘤。③所有病例与对照均为居住在当地20年以上的汉族常住人口。收集病例组研究对象的组织类型、TNM分期等临床特征，TNM分期采用UICC第七版肿瘤分期，组织类型根据2004年WHO公布的“肺及胸膜肿瘤组织学分类修订方案”进行分型，将大细胞肺癌和未分化及未定性肺癌统称为其他型肺癌。

1.1.2 试剂。人血液基因组DNA提取试剂盒购自厦门泰京生物技术有限公司，PCR反应试剂购自大连宝生物工程有限公司，MnlI、NciI限制性内切酶购自Fermentas公司，PCR扩增引物由上海生工生物有限公司设计合成。

1.1.3 仪器。PCR仪（德国EPPENDORF），VDS-CL凝胶成像系统（瑞典PHARMACZA，JS-680D），紫外分光分度计(BECKMAN，DU-640)，琼脂糖电泳仪（北京仪器厂），低温度高速离心机（力新仪器上海有限公司），恒温水浴箱（新康器械）。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA的提取。抽取每个研究对象外周肘静脉血5mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，紫外分光分度计对DNA的浓度和纯度进行检测，纯度保证( 260 nm/280 nm) OD 值在1. 8～ 2. 0 之间。DNA置-20℃低温冰箱保存备用。

1.2.2 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析。设计引物如下： GA(Glu 1013 Glu)（SNP No：rs2229765），sense primer：5’-CAGGGGTCGTTTGGGATGGTC-3’,anti sense primer 5’-CCTGTGCTGCATTTTGGCTTTTC-3，以MnlI酶切可得到不同的基因多态性片段分别为：GG: 103、84 bp；GA: 103、84、123bp；AA: 84、123bp。GA(Gly 1619 Arg) （SNP No：rs629849），sense primer：5’-AACAATGGTTAA- AGCCGGATTG-3’,anti sense primer ：5’-GGCCCGGGTGC- AGCCAGGCACTG-3’， 以NciI酶切可得到不同的基因多态性片段分别为：GG: 307、149 bp；GA: 456、307、149 bp；AA: 456bp。PCR扩增体系（25uL）含0.4umol/L上下游引物，0.02mmol/L dNTPs，1.25U TaKaRaTaq酶，1×PCR buffer， 100ngDNA模板，加蒸馏水至25ul。IGF-1R反应条件为：94℃变性20 s，54℃退火20 s，72℃延伸30s；共36个循环，末次循环后，72℃再延伸10 min，产物为207bp。IGF-2R反应条件为：94℃变性30 s，67℃退火60 s，72℃延伸30 s；共30个循环，末次循环后，72℃再延伸15 min，产物为456bp，以蒸馏水替代模板DNA 作为阴性对照。取10uL PCR反应产物、1U限制性内切酶，2uL 10×buffer tango，18uL无菌去离子水，37 ℃水浴过夜。取5uL酶切产物经3 g/L琼脂糖凝胶电泳, 100 V 20 min，凝胶成像系统显影，随机抽取10%的DNA 标本进行重复实验。