褪黑素对大鼠急性脊髓损伤内质网应激蛋白GADD153/CHOP表达的影响

[摘要] 目的 探讨褪黑素（MT）对急性脊髓损伤（ASCI）大鼠模型脊髓组织GADD153/CHOP表达的影响。 方法 选取健康SD大鼠96只，随机分为生理盐水处理组（NS组）、乙醇处理组（ET组）及褪黑素治疗组（MT组）各32只。所有大鼠均以改良Allen法制备脊髓损伤模型；MT组在模型制备的基础上给予褪黑素治疗；ET组在模型制备的基础上给予5%乙醇处理；NS组在模型制备的基础上给予0.9%氯化钠溶液处理。分别于伤后3 h、1 d 、3 d、7 d时各取8只应用改良 Tarlov评分法评价其神经功能；Tarlov评分后处死，取受损节段脊髓行HE染色及免疫组化染色，观察形态学改变和CHOP表达的特点；并应用TUNEL方法检测神经细胞凋亡情况。其量的评定借助于麦克奥迪数码医学图像分析系统A（Motic.med 6.0）软件，结果分别用累积光密度（IOD）及细胞凋亡指数（AI）来表示。 结果 所有实验大鼠脊髓组织均有不同程度出血、水肿、细胞凋亡及坏死。MT组Tarlov评分除3 h时间点外，其他各时间点Tarlov评分明显高于ET组及NS组，且差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。MT组与ET、NS组不同时间点CHOP表达、细胞凋亡差异有统计学意义，表现为除3 h时间点外，其他各个时间点MT组CHOP表达及细胞凋亡均明显低于其余两组（P < 0.05）。而ET、NS组之间各时间点CHOP表达、细胞凋亡比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 MT可抑制CHOP表达，降低脊髓细胞凋亡指数，可能为其发挥急性脊髓损伤保护作用的重要机制之一。

[关键词] 褪黑素；急性脊髓损伤；GADD153/CHOP；细胞凋亡；药物治疗

[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）06（a）-0013-04

现代研究结果显示[1]，急性脊髓损伤（actue spinal cord injury，ASCI）后存在广泛细胞凋亡现象。细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡，目前大量研究认为其对损伤后神经功能产生重要的影响[2]，是导致继发性脊髓损伤的主要原因[3]。以往认为细胞凋亡信号传导通路包括线粒体和死亡受体途径[4]。最新研究表明，内质网应激也参与了细胞凋亡，其中CHOP/GADD153（C/EBP homologous protein/growth arrest-and DNA damage inducible gene 153）是内质网应激特异的转录因子[5-6]，可由DNA生长停滞性损害诱导产生。黄怀等[7]发现内质网应激可以诱导大鼠ASCI神经细胞的凋亡，加重脊髓的损伤及神经功能障碍，该研究还发现ASCI组织CHOP表达含量的高低与ASCI的严重程度一致。CHOP又称内质网应激促凋亡蛋白，是继发性脊髓损伤发生机制的重要因素之一。褪黑素（melatonin， MT）是人体重要神经内分泌活性物之一，主要由松果体分泌，因此也称为松果体素。目前，MT对脊髓损伤的保护作用是国外研究的热点。据相关文献报道，MT对脊髓的保护作用主要通过线粒体通路或者死亡受体通路而实现，关于MT通过内质网通路发挥脊髓保护作用的文献鲜有报道。本实验旨在观察褪黑素对大鼠ASCI后脊髓组织内质网应激相关蛋白GADD153/CHOP表达的影响，探讨其对脊髓损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

96只健康6～8周SD大鼠，雌雄各半，体重200～250 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司[许可证号SCXK（湘）2009-0004]，在中南大学实验动物学部[许可证号：SYXK（湘）2005-0005]分笼饲养。采用单盲法将96只大鼠随机分为3组，生理盐水处理组（NS组）、乙醇处理组（ET组）及褪黑素治疗组（MT组）各32只；根据损伤的时间点又分为3 h、1 d、3 d、7 d 4个处理组，每组8只，雌雄各半，在相应时间点进行指标考察。

1.2 动物模型制备

以改良Allen法制备脊髓损伤大鼠模型。制备方法：（1）1%戊巴比妥钠（0.1 mL/kg）腹腔注射麻醉，俯卧位固定于解剖板；（2）以浮肋与13胸椎连接处为基准点，在5 cm2范围内脱毛，显露光滑皮肤组织；（3）酒精消毒，以消毒器械操作，在后正中线2～3 cm做纵行切口，依次切开皮肤、筋膜，可见白色腱膜；（4）借助剥离分针钝性剥离椎旁肌肉丛，可暴露棘突、椎板和横突；（5）定位并标记T10胸椎，在椎体上下中横向切口，再以2个纵向切口将其连接成方形结构，并以咬骨钳去除该骨板，显露方形骨窗；（6）以自制Allen撞击器打击T10胸椎内侧，保持自由落体运动，控制高度为2.5～3.0 cm，每次击打保持在打击点提留2～3 min；（7）至脊髓组织出现血肿，硬脊膜呈紫红色停止击打，缝合伤口；（8）术后单笼饲养，每1小时给大鼠翻身一次，直至大鼠完全清醒；（9）青霉素联合庆大霉素抗感染，并人工辅助排尿、排便，保持垫料清洁，并及时清理伤口分泌物；（10）术后30 min给予药物处理：MT组给予腹腔内注射褪黑素（Sigma，100 mg/kg），按照褪黑素说明书要求，用无水乙醇（安徽安特生物化学有限公司）对褪黑素进行溶解，并以0.9%氯化钠溶液进行稀释，其稀释浓度为5%。NS组和ET组以同样方法给予同剂量的0.9%氯化钠溶液或5%乙醇。

1.3 神经功能评价

本实验对大鼠术后清醒初期做首次Tarlov评分，剔除0分及5分大鼠（完全性瘫痪大鼠恢复的可能性很少，完全正常者没有评估的价值），并补充后备实验大鼠，以保证实验大鼠的可比性；1～4分者大鼠继续实验，分别选取术后3 h、1 d、3 d、7 d 4个时间点，按照改良Tarlov标准进行神经功能评定，（表1）。

表1 改良Tarlov评分标准

1.4 心脏灌注和组织观察

1.4.1 心脏灌注 （1）1%的戊巴比妥钠（0.1 mL/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于解剖板，自腹腔中线开始解剖，向上打开胸腔，适当断除肋骨，暴露心脏；（2）以止血钳牵拉，撑开心脏入口，固定两侧肌肉，进行心脏穿刺；（3）用中号静脉滴注针头（磨除针尖）自左心尖斜行穿至右侧主动脉，动脉夹固定针头，剪破右心耳；（4）先以50 mL注射器推注0.9%氯化钠溶液4～5针（200～250 mL），控制适当流速，勿鼓破血管，至肝脏颜色无色、右心耳流出的液体澄清，体循环内血液彻底流出；（5）拔掉注射器，连接4%多聚甲醛滴注瓶，排除气泡，进行多聚甲醛灌注固定40～90 min，大鼠身体可完全僵硬。

1.4.2 组织提取 以T9～T11胸椎为中心，取损伤阶段脊柱约2 cm，以巩膜咬切器仔细咬去椎板、椎体和周围附着的瘢痕组织，将完整的脊髓组织剥离出来，置于4%多聚甲醛固定保存。

1.4.3 组织形态学观察 组织浸泡24 h以上，常规石蜡包埋，作损伤中心部位连续切片4张，HE染色，显微镜观察形态学病理特征。

1.5 免疫组织化学染色

常规石蜡包埋，作损伤中心部位连续切片4张，5 μm厚度切片，随即抽取2张切片进行免疫组织化学染色。采用HPIAS-1000图像分析系统分析图像；高倍镜下，每张切片随机选取5个视野，测定累计光密度（integrated optical density， IOD）；取平均值。

1.6 缺口原位末端标记法（TUNEL）染色

常规石蜡包埋，作损伤中心部位连续切片4张，5 μm厚度切片，随机抽取切片1张，进行TUNEL染色。主要过程包括：（1）脱蜡入水后，室温下0.3%H2O2处理10 min，0.01 mol/L PBS漂洗，晾干；（2）按说明书要求制备TUNEL反应混合液，以移液器加样，每张玻片滴加25 μL；（3）设阴性对照组和阳性对照组，阴性对照组以去离子水作为酶代替物，阳性对照组按说明书要求制备标准品代替样品，再加反应混合液25 μL，恒温培养箱避光孵育，37℃ 60～90 min；（4）按DAB试剂盒说明书要求进行DAB染色，并以显微镜观察背景亮度；（5）苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片；（6）40倍电镜下采集图像，黄褐色颗粒为阳性细胞，每张切片取5个视野，计算AI，AI即为凋亡细胞核数占总细胞核数的百分率，AI越大，细胞凋亡数越多。

1.7 统计学分析

应用SPSS 17.0进行统计分析；两组间比较行t检验，多组间比较行F检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学Tarlov评分

本实验对各组大鼠节选4个点进行Tarlov评分，结果显示，所有大鼠均出现不同程度下肢功能障碍；术后3 h，各组大鼠Tarlov评分表现出轻微差异，但与其余两组差异无统计学意义（P > 0.05）；术后1 d，MT组Tarlov评分显著优于NS组和ET组（P < 0.05）；随着时间的延长，其差异值逐渐增大，以术后3 d最为明显（P < 0.01）；术后7 d其差值有所降低，但差异有统计学意义（P < 0.05）；NS组和ET组之间各时间点Tarlov评分差异无统计学意义（P > 0.05）（表2、图1）。

表2 各组大鼠不同时间点Tarlov评分（分，x±s，n = 8）

注：与MT组相比，*P < 0.05，#P < 0.01

图1 各组大鼠术后各时段神经功能评分变化规律

2.2 组织学检查

各组大鼠脊髓组织均可见血肿，细胞核碎裂、皱缩，或溶解；细胞排列紊乱、密度稀疏、呈空泡状结构，数量明显减少。所有试验动物脊髓组织1 d出现明显凋亡特征，3 d更为严重，7 d后有所缓解，治疗组1 d后各时间段细胞凋亡较对照组明显减少。

2.3 CHOP表达情况

各组大鼠脊髓组织均有CHOP的表达，MT组各时间点大鼠脊髓组织CHOP的表达与其余两组相比，结果如下：术后3 h，各组大鼠之间差异无统计学意义（P > 0.05）；术后1 d，MT组IOD显著优于NS组和ET组（P < 0.05）；随着时间的延长，其差异值逐渐增大，以术后3 d最为明显（P < 0.05）；术后7 d，差异值有所减小，但差异具有统计学意义（P < 0.05）；NS组和ET组之间各时间点IOD差异无统计学意义（P > 0.05）；各组大鼠且脊髓组织CHOP表达整体趋势呈现出3 h

2.4 细胞凋亡情况

所有实验动物大鼠脊髓组织于损伤后3 h即出现细胞凋亡，各组大鼠脊髓组织均有CHOP的表达，MT组各时间点大鼠脊髓组织AI与其余两组相比，结果如下：术后3 h，各组大鼠之间差异无统计学意义（P > 0.05）；术后1 d，MT组IOD显著优于NS组和ET组（P < 0.05）；随着时间的延长，其差异值逐渐增大，以术后3 d最为明显（P < 0.05）；术后7 d，差异值有所减小，但差异具有统计学意义（P < 0.05）；NS组和ET组之间各时间点AI差异无统计学意义（P > 0.05）；各组大鼠AI整体趋势呈现出3 h

表4 各组大鼠不同时间点细胞凋亡情况（%，x±s，n = 8）

注：与MT组相比，*P < 0.05

3 讨论

脊髓损伤是临床常见病、多发病，由于其具有发病突然、不可预料及损伤严重、致残率高、缺乏有效治疗和发病率逐年增加等特点，目前已成为临床研究的热点及难点。研究表明，脊髓损伤具有原发性和继发性两种形态，原发性损伤又称不可逆损伤，是指脊髓组织在受损第一时间由机械外力产生的压迫性损伤，一般无法有效避免及治疗；而继发性损伤是在原发性损伤的基础上，脊髓组织呈现出的继发性病理改变或进行性进展，可加重脊髓损伤患者的伤残及治疗的难度，其所产生的危害远远大于原发性损伤。因此，有效针对损伤机制干预继发性脊髓损伤是治疗的关键。MT是人体重要的神经内分泌活性物之一，对生物的自然生长过程和基本生理功能起重要的调节作用，包括昼夜节律、生殖、衰老、应激、免疫等[8]。研究表明，MT具有较强的抗氧化应激性损伤样作用，可清除体内多余羟自由基和过氧自由基[9]，是目前已知的人体可自给产生的最强的抗氧化成分。另有研究表明，MT抗氧化损伤活性直接通过清除自由基实现，不需要其受体调节[10]。