降解多菌灵木霉Tr1原生质体制备及再生条件研究

摘要：研究可降解多菌灵的木霉菌株tr1的原生质体制备及再生的适宜条件，发现该菌原生质体制备的最佳条件为菌龄20 h，裂解酶液为5 mg/mL的溶菌酶和蜗牛酶的混合酶液，二者使用前按照体积比2∶1混合，酶解温度30 ℃，50 r/min缓慢振荡酶解2.5 h，渗透压稳定剂为0.7 mol/L KCl，原生质体产量达6.44×106个/mL。原生质体再生的优化条件为：PDA为培养基，添加0.3 mol/L KCl和0.3 mol/L环己六醇作为渗透压稳定剂，采用双层固体培养方式，有助于原生质体的再生。

关键词：多菌灵；木霉；原生质体；制备；再生

中图分类号：Q939.96 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）10-2500-04

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.10.014

Abstract：The suitable preparation and regeneration conditions of protoplast preparation of Trichoderma sp. Tr1 was studied. The results showed the optimum condition for preparation of protoplast of strain Tr1：The culture time of mycelium was 20 h， the protoplast lysate was a mixed solution of 5 mg/mL lysozyme and 5 mg/mL snail enzyme and they would be mixed according to the volume ratio of 2∶1 before using， it was mildly shaked with a speed of 50 r/min under 30 ℃ for 2.5 h， 0.7 mol/L KCl was used as osmotic stabilizer. Under this condition， the yield of protoplast could be 6.44×106/mL. The optimum condition for regeneration of protoplast was PDA as the basic culture medium，0.3 mol/L KCl and 0.3 mol/L inositol as the osmotic stabilizer， and double-layer solid culture was helpful for protoplast regeneration of Trichoderma sp. Tr1.

Key words： carbendazim； Trichderma sp.； protoplast； preparaton； regeneration

多菌灵（Carbendazim，MBC）是一种高效广谱的苯并咪唑类杀菌剂，其广泛使用给生态环境和人体健康造成了危害[1]。为解决多菌灵农残污染问题，人们开始研究多菌灵降解菌株，目前报道的降解菌株多为细菌，如红平红球菌、假单胞菌等[2，3]。虽然部分菌株对多菌灵的降解效率较高，但由于菌株本身对植物病原菌没有拮抗作用，功能单一且制剂保存期短，市场应用前景受到限制。

木霉菌是一类重要的植物病生防菌，研究和应用广泛[4]。但多数木霉菌株对多菌灵敏感，因此多菌灵在土壤中的残留影响了木霉的生防效果。筛选和选育降解多菌灵的生防木霉菌，将实现生防和降解农残功能的有机结合。2008年田连生等[5]首次报道一株木霉对多菌灵有一定的降解能力。前期试验筛选到一株可降解多菌灵的生防木霉，但降解效率低。应用原生质体融合技术是目前得到优良菌种的有效方法之一，原生质体没有细胞壁，对诱变剂反应灵敏，容易得到正突变株[6，7]。因此利用原生质体融合技术对哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和其他对多菌灵敏感的木霉生防菌株进行种间杂交，有望选育出对多菌灵高效降解的生防木霉菌株。本研究对可降解多菌灵的哈茨木霉Tr1原生质体的制备条件进行了研究，为新菌种的选育奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

哈茨木霉Tr1为山东省应用微生物重点实验室分离获得，对多菌灵具有一定的降解作用，同时对部分植物病原真菌具有一定的抑菌效果。

1.2 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂10 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

无机盐培养基：NH4NO3 1.0 g，NaCl 1.0 g，K2HPO4 1.5 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4・7H2O 0.2 g，琼脂10 g，蒸馏水 1 000 mL，多菌灵（100 mg/mL）10 mL。

液体培养基：葡萄糖1 g，蛋白胨0.4 g，酵母膏0.4 g，KH2PO4 0.2 g，K2HPO4 0.4 g，MgSO4・7H2O 0.005 g，pH 6.2～6.4。

STC培养液：0.6 mol/L山梨糖醇，0.01 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L CaCl2，pH 7.5。

原生质体再生培养基：培养基A，马铃薯200 g，葡萄糖10 g，0.3 mol/L KCl，0.3 mol/L环己六醇；培养基B，马铃薯 200 g，蔗糖10 g，0.3 mol/L KCl， 0.3 mol/L环己六醇；培养基C，马铃薯 200 g，葡萄糖10 g，0.6 mol/L KCl；培养基D，马铃薯 200 g，葡萄糖10 g，0.6 mol/L环己六醇；培养基E，马铃薯 200 g，蔗糖10 g，0.6 mol/L KCl；培养基F，马铃薯 200 g，蔗糖10 g，0.6 mol/L环己六醇。

1.3 试剂

酶：利用渗透压缓冲液分别配制浓度为5 mg/mL的蜗牛酶、纤维素酶和溶菌酶，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4 ℃保存备用。

渗透压缓冲液：0.7 mol/L KCl，0.1 mol/L PBS，pH 5.8。

1.4 菌丝的制备

在多菌灵为惟一碳源的无机盐平板上培养哈茨木霉Tr1 5～7 d，用无菌水洗下孢子，配成1×107个/mL的孢子悬浮液，按照1%的接种量接种到PD培养基中，28 ℃、150 r/min摇床培养8～24 h。

1.5 原生质体的制备

取摇床培养好的哈茨木霉菌丝培养液，用3层无菌纱布过滤收集菌丝体，用去离子水冲洗3次，用渗透压缓冲液冲洗至菌丝呈半透明状，收集菌丝并称重。按照一定的比例加入新配制好的酶液，30 ℃、50 r/min缓慢摇床培养，定期镜检，发现有大量原生质体形成后，用3层无菌擦镜纸过滤菌丝，用渗透压稳定剂冲洗3次，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，收集原生质体，利用STC洗涤原生质体3次，最后悬浮于STC培养液中，原生质体浓度调整为1×106个/mL。

1.6 不同因素对原生质体形成的影响

1.6.1 菌丝培养时间对原生质体形成的影响 将活化后的木霉Tr1分生孢子接入PD培养液中，分别培养12、16、20、24、28、32、36、40 h，然后称取50 mg菌丝，加入1 mL酶液，充分混匀，30 ℃振荡酶解2.5 h，比较原生质体形成情况。

1.6.2 最佳酶系统的确定 分别设置不同的酶浓度和酶组分，取1 mL酶液加入到50 mg菌丝中，充分混匀，30 ℃、50 r/min缓慢摇床培养2 h，制备原生质体，镜检观察，计算原生质体产量，确定最佳酶组合。

1.6.3 酶解时间、温度、pH对原生质体形成的影响 1 mL酶液对50 mg菌丝进行酶解，分别进行酶解时间、温度和pH的单因素试验，镜检比较原生质体的形成情况。酶解时间设为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h；酶解温度设置为20、25、30、35、40 ℃；pH设置为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0。

1.6.4 渗透压缓冲液对原生质体形成的影响 分别以0.7 mol/L甘露醇、蔗糖、MgSO4、NaCl替代渗透压缓冲液中0.7 mol/L KCl作为稳定剂，用上述不同渗透压缓冲液配制酶液进行原生质体的制备，30 ℃酶解2 h后制备原生质体，镜检比较原生质体的形成情况。

1.7 原生质体的再生

1.7.1 再生培养基的选择 取制备好的木霉Tr1原生质体悬浮液1 mL与不同的再生培养基轻轻混合，培养3 d，统计不同再生培养基的再生菌落数。

1.7.2 再生方式选择 A：单层平板培养，将制备的原生质体悬浮液适当稀释后吸取1 mL与冷却至40 ℃左右的再生培养基轻轻混合倒入平板，培养3 d，统计再生菌落数。B：先在培养皿底部铺上一层PDA培养基，将制备的原生质体悬浮液适当稀释后吸取50 μL与冷却至40 ℃左右的再生培养基轻轻混合，倒入上述平板，培养3 d，统计再生菌落数。

1.8 原生质体灭活

1.8.1 木霉Tr1原生质体的热灭活 取一定浓度的木霉Tr1原生质体悬浮液（1×106个/mL）分别置于50、55、60、65 ℃恒温水浴箱中进行热灭活，同一温度分别于灭活时间5、10、15、20、25、30 min各取出等量原生质体悬液进行再生培养，以未进行热灭活的原生质体为对照。

1.8.2 木霉Tr1原生质体的紫外灭活 取一定浓度的木霉Tr1原生质体悬浮液（1×106个/mL）等量于无菌培养皿中，分别与15 W紫外灯距离5、10、15、20 cm处照射5 min，各取出等量原生质体悬浮液进行再生培养，以未进行紫外灭活的原生质体为对照。

2 结果与分析

2.1 原生质体的制备

2.1.1 菌丝培养时间对原生质体产量的影响 以溶菌酶和蜗牛酶的混合酶为酶系统，30 ℃处理不同时间段的木霉菌丝细胞壁2.5 h，试验结果见图1。由图1可知，木霉菌丝培养20 h后，原生质体制备的量最多，达到了6.45×106个/mL。因此，在后续试验中，选择培养20 h的木霉菌丝进行原生质体的制备。

2.1.2 不同酶系统对木霉Tr1原生质体产量的影响 原生质体释放的关键因素之一就是酶系统的选择，不同属真菌的细胞壁因其化学组分不同，对其破壁所需的酶系统要求也存在差异。本试验采用不同酶组合对培养20 h的菌丝体进行处理，结果见表1。

由表1可知，单一的溶菌酶和蜗牛酶或者相互之间组合后的混合酶来对木霉菌丝进行破壁处理，均可产生一定的原生质体，其中效果最好的为溶菌酶和蜗牛酶组合后的混合酶，由该混合体系处理木霉细胞壁，其原生质体产量达到了6.35×106个/mL。因此在后续试验中均采用此酶组合。

2.1.3 酶解时间对原生质体产量的影响 以溶菌酶和蜗牛酶组合的混合酶系处理木霉细胞壁，随着酶解时间的延长，原生质体的产量逐渐增加，酶解2.5 h时，原生质体产量达到最大（6.53×106个/mL）（图2），其后原生质体产量下降，因此后续试验确定2.5 h为最佳酶解时间。

2.1.4 酶解温度对原生质体产量的影响 酶解过程中所用的温度分别为20、25、30、35、40 ℃，结果见图3。由图3可知，随着酶解温度的增加，原生质体的产量逐渐增加，酶解温度为30 ℃时，原生质体产量最大，达到了6.51×106个/mL。其后，随着温度的升高，原生质体产量下降，说明30 ℃是溶菌酶和蜗牛酶混合后共同作用于木霉细胞壁的最佳温度。

2.1.5 渗透压缓冲液pH对原生质体产量的影响 以0.1 mol/L磷酸盐缓冲液为缓冲体系，检测不同缓冲液的pH对原生质体产量的影响，结果见图4。由图4可知，pH 6.0时，酶的活性较高，对木霉细胞壁处理较好，原生质体产量达到了6.48×106个/mL，本试验最初选择pH 5.8的磷酸盐缓冲液配制渗透压缓冲液，因此在后续的试验中缓冲液pH均为5.8。

2.1.6 渗透压缓冲液对原生质体产量的影响 渗透压稳定剂在维持原生质体内外环境渗透压的稳定性方面起着至关重要的作用。本试验分别以0.7 mol/L甘露醇、蔗糖、MgSO4、NaCl替代渗透压缓冲液中0.7 mol/L KCl作为稳定剂，处理木霉菌丝2.5 h，结果见图5。由图5可知，分别以甘露醇和KCl作为渗透压稳定剂时，木霉Tr1原生质体的产量都超过了6.44×106个/mL，二者在0.05水平上差异不显著。一般认为，原生质体制备时无机盐作为高渗稳定剂的效果较好，本研究发现甘露醇和KCl两者之间差异不显著，但因为有机物较无机盐成分复杂，因此在后续的试验中，主要以KCl作为渗透压稳定剂。

2.2 原生质体的再生

对于木霉原生质体融合育种，重要的一环是必须使原生质体再生成具有细胞壁的细胞，这样才能对产生的融合子进行遗传鉴别、筛选和利用。综合已发表的文献，将稀释后的原生质体悬浮液分别涂布到6种再生培养基上，培养后统计再生菌落数，结果见图6。由图6可知，在PDA培养基中添加0.3 mol/L KCl和0.3 mol/L环己六醇，有利于木霉Tr1原生质体的再生。试验中发现木霉Tr1在单层平板培养基和双层固体平板培养基上均可以长出菌落，但在双层培养基上更容易长出菌落，且长的菌落比较均匀，该再生方式同王升星等[8]的报道结果相同。

3 小结与讨论

原生质体的制备是丝状真菌融合或转化的一个关键点，要制备数量较多且质量较高的原生质体，需要对不同菌株的菌丝进行合适的处理才可以形成大量的原生质体[9]。本研究对分离筛选到的多菌灵降解木霉Tr1进行原生质体制备条件的研究，发现培养的木霉菌丝如果菌龄过长，则菌丝细胞壁老化而增厚，不利于原生质体的释放；而菌龄较短，则菌丝容易断裂，释放的原生质体较少。本研究中培养20 h的木霉菌丝，生长旺盛，菌丝量比较多，适于制备大量的原生质体。因此，针对多菌灵降解木霉Tr1，选择培养20 h的木霉菌丝进行原生质体的制备。

本研究中对影响木霉Tr1原生质体制备的因素进行分析，得出其原生质体制备的最适条件：在菌丝体培养20 h的基础上，分别用5 mg/mL的溶菌酶和蜗牛酶按照体积比2∶1混合， pH 5.5～6.5，按照菌丝重量与酶液体积比（50∶1，mg∶mL）处理菌丝，50 r/min缓慢振荡，30 ℃酶解菌丝2.5 h，以0.7 mol/L KCl作为渗透压稳定剂，在上述条件下，原生质体产量达6.44×106个/mL。王升星等[8]建议酶解前用巯基乙醇处理木霉菌丝，可增加菌丝对酶处理的敏感性，本研究中曾用巯基乙醇处理，发现意义不大，推测培养20 h的菌丝完全适合原生质体的制备。对木霉Tr1原生质体的再生条件进行了研究，发现PDA培养基中添加0.3 mol/L KCl和0.3 mol/L环己六醇有利于原生质体的再生。试验中发现木霉Tr1在单层平板培养基和双层固体平板培养基上均可以长出菌落，但在双层培养基上更容易长出菌落，且长出的菌落比较均匀，该再生方式同王升星等[8]报道结果相同。

参考文献：

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[2] ZHANG X，HUANG Y，HARVEY P R，et al.Isolation and characterization of carbendazim-degrading Rhodococcus erythropolis djl-11[J]. PLOS One，2013，8（10）：1520-1538.

[3] FANG H，WANG Y Q，GAO C M，et al. Isolation and characterization of Pseudomonas sp. CBW capable of degrading carbendazim[J]. Biodegradation，2010，21（6）：939-946.

[4] 杨合同.木霉分类与鉴定[M].北京：中国大地出版社，2009.

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[8] 王升星，林 莉，朱丽云.绿色木霉原生质体制备与再生条件的探索[J].安徽农业科学，2010，38（8）：3931-3934.

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