热水法提取香菇多糖和茶树菇多糖研究

摘要：真菌多糖具有降血糖、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒和免疫调节等多种生理功能，且对机体毒副作用小，具有广阔的开发前景。以营养价值和药用价值均较高的香菇（Lentinus edodes）、茶树菇（Agrocybe aegirit）为原料，用热水提取法在90 ℃、料液比1∶20（g∶mL）、提取1次、4 h的条件下，提取两种真菌多糖。结果表明，热水法提取香菇多糖的得率为9.70%，茶树菇多糖的得率为13.10%，说明茶树菇中的多糖含量高于香菇。该研究可为后续开发利用真菌多糖提供重要依据。

关键词：香菇（Lentinus edodes）；茶树菇（Agrocybe aegirit）；多糖；热水提取法

中图分类号：S646.1+2；S646.9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）16-4258-03

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.16.047

真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体和发酵液中分离出的一种活性物质。真菌多糖具有降血糖、免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗突变、抗衰老和抗炎等多种生理功能[1]。在一些食用菌中含有多种真菌多糖，如香菇（Lentinus edodes）、茶树菇（Agrocybe aegirit）、猴头菇（Hericium erinaceus）等。香菇多糖一级结构的主链为β-（1，3）-D-葡聚糖，在主链的C6位上含有支点（每5个葡萄糖有2个支点），其支链由β-（1，6）键和β-（1，3）键相连的葡聚糖组成，在支链上也含有少数内部β-（1，6）键[2]。目前，在医药和保健品行业，香菇多糖产品具有极大的市场前景。茶树菇多糖的含量很高，可达干重的30%～40%，主要成分为α-（1，3）-D-葡聚糖，还含有甘露糖、半乳糖、鼠李糖、木糖及阿拉伯糖等[3]。其药理作用十分广泛，是一种极具开发前景的真菌多糖。20世纪60年代以后，随着真菌多糖生物活性不断被发掘，越来越多的真菌多糖产品被开发，应用于保健品和医药行业。

目前，国内外已从近300种真菌中分离出200多种有生物活性的多糖物质[4]。专家预言，21世纪将是多糖的时代。显然，如何提高真菌多糖的得率和品质已成为首要解决的问题。

现在常用的提取真菌多糖的方法有：热水提取法、酸提法、碱提法、酶法等。酸、碱提法虽耗时短，提高了多糖得率，但易破坏多糖结构；酶法反应条件温和，但较难控制试验条件，对操作要求高。而热水提取法因操作简单、有机溶剂使用量少、对多糖的生物活性破坏小和试验成本低，成为目前提取真菌多糖最常用的方法。热水法提取真菌多糖时，原料的粉碎程度、提取温度、时间、次数、料液比以及醇析时乙醇添加倍数都可能影响多糖得率。苏红等[5]研究发现当原料粉碎度达到70目以上时，粉碎度对多糖提取率的影响较小，且粉碎度过高反而会降低多糖得率。真菌多糖的提取率常随温度的升高而增大，但温度太高则会破坏多糖的结构，所以提取温度常据经验和试验条件控制在90 ℃左右[5]。一般而言，真菌多糖的最佳提取时间在3 h以上，且时间越长，多糖得率越高，但超过一定时间，多糖得率升高不明显。李浩飞等[6]在研究桦褐孔菌多糖的水提工艺时，得出结论：当料液比为1∶5、1∶10、1∶20 （g∶mL，下同）时，提取次数这一因素影响不大，且提取1次即可。目前，国内许多学者对热水提取法的工艺进行了研究和优化，得到的结果一般是提取温度90～100 ℃，提取2～4 h。

因此，在充分研究热水提取法对多糖得率的影响因素和条件设置基础上，该研究通过热水提取法对香菇多糖和茶树菇多糖进行了提取，并比较两者的多糖得率，进而比较香菇和茶树菇中多糖含量，以期指导工业生产选取合适的原材料，来获得较高的多糖产量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干香菇、干茶树菇、葡萄糖、蒸馏水、乙醇（密度0.79 g/mL）、氯仿、正戊醇、浓硫酸、苯酚（除硫酸为优级纯外，其他试剂均为分析纯）。

1.2 仪器与设备

202型电热恒温干燥箱、LFP-2500A型高速多功能粉碎机、722S型可见光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；TD5-Ⅱ型低速多管架自动平衡离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵（上海青浦沪西仪器厂）；HH-42型数显恒温三用水箱。

250 mL锥形瓶、玻璃棒、500 mL抽滤瓶、电子天平、药匙、称量纸、滤纸、布氏漏斗、剪刀、容量瓶、量筒、试管、试管架、胶头滴管、移液枪、枪头、比色皿、15 mL EP管、20目筛子。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的制备 105 ℃干燥葡萄糖至恒重，称取100.0 mg，加蒸馏水溶解后定容于100 mL容量瓶中，摇匀，配成浓度为1 mg/mL标准葡萄糖溶液。吸取已配制的葡萄糖标准品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL置于6个50 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度线，摇匀。准确吸取2 mL，分别加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入5 mL浓硫酸，振摇5 min，置沸水中加热15 min，然后于冷水浴中冷却30 min，以溶剂蒸馏水为空白作对照。

在490 nm条件下，测吸光度，记录数据。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得出葡萄糖标准品浓度X（mg/mL）与吸光度Y的回归方程。

1.3.2 粗多糖的提取 将干香菇或干茶树菇粉碎，用20目的筛子筛取同样大小的粉末。称取粉末5.0 g，倒入250 mL锥形瓶中，加入蒸馏水100 mL，混合均匀后置于90 ℃恒温水浴锅中，每隔15 min用玻璃棒搅拌数次，水浴4 h后结束，冷却至室温。

减压抽滤，收集滤液并记录其体积。取滤液 2 mL于15 mL EP管中，加6 mL无水乙醇，3 000 r/min离心10 min后，倾去上清液；再加6 mL 80%乙醇，同样条件离心5 min，重复2次，将沉淀于60 ℃烘干，得多糖粗品。

1.3.3 脱蛋白 将多糖粗品用水溶解，并转移至100 mL容量瓶中定容。接着吸取定容液3 mL分别稀释0、10、20、30倍，并对应编号，取稀释液3 mL于EP管中，加入3 mL的氯仿-正戊醇（体积比为 4∶1）混合试剂，充分振摇5 min，3 500 r/min离心15 min，取上清。重复上述操作共3次。

1.3.4 多糖的测定 分别吸取2 mL上清液于试管中，各加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入5 mL浓硫酸，振摇5 min，置沸水浴中加热15 min，然后置冷水浴中冷却30 min，以溶剂蒸馏水为空白作对照。 在490 nm处测吸光度，记录数值。

确定多糖测定的稀释倍数后，按上述试验过程操作测多糖得率（粗多糖定容后，只需稀释至已确定的倍数）。一次试验平行测3组数据。

多糖得率=[（多糖浓度×稀释倍数×滤液体积）/（2×5×1 000）]×100% （数字2代表试验中吸取的 2 mL滤液，5代表原料质量5 g，1 000代表质量单位g换算成mg，稀释倍数为1 000倍）。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

绘制葡萄糖溶液标准曲线如图1。葡萄糖标准品浓度X（mg/mL）与吸光度Y的回归方程：Y=16.021X，R2=0.993 6。

2.2 多糖稀释倍数的确定

由表1中可知，将2 mL茶树菇滤液中的多糖稀释100倍，吸光度大于1，数值不可信；稀释1 000倍所测的数值比稀释2 000倍、3 000倍更接近数值0.5，测得数据更准确。所以，确定测定多糖前需将 2 mL滤液中多糖稀释1 000倍。

2.3 茶树菇多糖和香菇多糖得率的计算

称取5 g茶树菇粉末和5 g香菇粉末，各加入100 mL蒸馏水溶解，经热水提取法提取多糖后进行减压抽滤，分别得到的滤液体积为80、58 mL。分别取2 mL滤液进行后续的多糖纯化。由表2可知，测得茶树菇多糖吸光度的平均值为0.263（试管4中测得的茶树菇多糖的吸光度误差较大，故舍去），测得香菇多糖吸光度的平均值为0.267。将多糖的吸光度代入标准曲线算出其浓度，最后根据下式计算多糖的得率。最终得出热水法提取的茶树菇多糖得率为13.10%，香菇多糖得率为9.70%。预估茶树菇中的多糖含量高于香菇。

3 讨论

对于热水法提取香菇多糖的研究，谢红旗[7]在试验中发现，最佳工艺参数为料液比1∶20，温度95 ℃，提取4 h；此时多糖的提取率为4.68%。王卫国等[8]在对香菇多糖的热水提取法进行优化研究中得出，香菇多糖提取的最佳条件为料液比1∶20，温度96 ℃，提取4 h，多糖得率为6.50%。曾智平[9]确定了传统热水法提取香菇多糖最优条件为料液比1∶20，温度90 ℃，提取3 h，多糖得率为9.97%。

对茶树菇多糖的热水法提取工艺，赵艳[1]通过响应面法进行了优化，最终得到的最佳提取条件为料液比1∶50、温度95 ℃、提取4 h。在这种方法下，多糖得率为3.10%。陈发河等[10]研究发现，提取茶树菇多糖的最适条件为料液比1∶20、温度70 ℃、提取时间 3 h。茶树菇多糖的平均得率为3.85%。廖丹葵等[11]采用正交试验考察了热水法提取茶树菇多糖的工艺，在料液比1∶20、温度为90 ℃和提取4 h，3次共12 h条件下，茶树菇多糖得率最高为6.13%。

由上述分析可知，研究者们确定的提取香菇多糖、茶树菇多糖的料液比的最佳条件大都为1∶20；而在90 ℃条件下，二者的提取率均为最高，因而90 ℃为最适温度。一般而言，真菌多糖的最佳提取时间在3 h以上，且在一定范围内，时间越长，多糖得率越高，所以本试验提取时间设置为4 h。李浩飞等[6]在研究桦褐孔菌多糖的水提工艺时，得出结论：当料液比为1∶20时，提取次数这一因素影响不大，提取1次即可。综合考虑各因素后，本试验将热水提取法的条件设置为：料液比1∶20、温度90 ℃、提取1次、提取时间4 h。

经乙醇沉淀得到的粗多糖，尚有蛋白质等杂质的存在，必须除去。研究表明，Sevag法是目前最温和的除蛋白质方法[12]。多糖中的蛋白质含量会随着脱蛋白次数的增加而减少，经6次脱除处理后，多糖中的蛋白质几乎可全部除去。但在此过程中，每脱除一次蛋白，会损失部分多糖。且脱除处理超过3次后，蛋白质含量减少的幅度明显减缓；而前3次脱除的蛋白质的量可占脱除蛋白质总量的87.7%[13]。考虑到既要尽可能多的脱除蛋白，又要减少多糖的损失，本试验脱除蛋白最终采用了Sevag法，共3次。

在多糖测定的方法学研究中，于村等[14]以香菇为原料比较了直接滴定法、蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法这三种常见方法。结果表明，直接滴定法的灵敏度较低，蒽酮-硫酸法测得的多糖含量过高，苯酚-硫酸法的准确性最好，是测定多糖含量最理想的方法。因而，本试验选择了苯酚-硫酸法测定多糖。

综上所述，试验中每一步骤的设置，从热水法提取粗多糖、蛋白质的去除到多糖的测定，均采用了目前研究认定的最佳条件。所以，本试验方案具有系统性、科学性以及可行性。

本试验用热水法在90 ℃、料液比为1∶20、提取1次、4 h的条件下提取香菇多糖和茶树菇多糖，通过计算得出香菇多糖得率为9.70%，茶树菇多糖得率为13.10%。说明了茶树菇中的多糖含量高于香菇。该结果为后续多糖物质的提取利用提供了重要依据。

目前，国内外对真菌多糖生物活性的研究取得了骄人的成绩，现已利用其抗病毒、抗癌等活性制备出各类新药、保健品及功能食品等，但对于真菌多糖的高级结构及其作用机制，以及多糖的结构与功能之间的关系，还知之甚少。因此，在今后的工作中，应加强这些方面的研究。

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