激动维甲类X受体抑制心肌细胞缺氧/复氧损伤

【摘要】目的 探讨激动维甲类X受体（retinoid X receptor，RXR）对大鼠心肌细胞H9c2缺氧/复氧（hypoxia-reoxygenation，H/R）损伤的保护作用及其机制。方法 将心肌细胞缺氧2 h/复氧4 h，建立H/R损伤模型。以9-顺式维甲酸（9-cis retinoid acid，c-RA）为RXR激动剂，HX531为RXR拮抗剂，实验随机（随机数字法）分4组：健康对照组（N组）、H/R损伤组、H/R+100 nmol/L c-RA组（RA组）、H/R+100 nmol/L c-RA+2.5 μmol/L HX531组（HX组），MTT法检测细胞活性，流式细胞技术检测细胞凋亡比例，荧光探针JC-1测定线粒体膜电位，Western blot印迹法检测Bcl-2、Bax及活性片段Caspase-9蛋白表达。所有计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，Dennett-t检验，以P

【关键词】维甲类X受体；心肌细胞；凋亡；线粒体；缺氧/复氧

Activating retinoid X receptor protected rat cardiomyocytes H9c2 from hypoxia/reoxygenation injury SHAN Pei-ren*， HUANG Zhou-qing， PU Jun， HUANG Wei-jian. Department of Cardiology，*The First Affiliated Hospitaf of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China

Corresponding author： PU Jun， Email： ； HUANG Wei-jian， Email：

【Abstract】Objective To determine the protective effects and potential mechanism of activating retinoid X receptor （RXR） on rat cardiomyocytes H9c2 against hypoxia/reoxygenation （H/R） induced oxidative injury. Methods The model of H/R injury was established with hypoxia for 2 hours and reoxygenation for 4 hours in cardiomyocytes of H9c2， and 9-cis-retinoic acid （c-RA） was obtained as RXR agonist， and HX531 as RXR antagonist. Cultured cardiomyocytes were randomly（random number） divided into four groups： sham group， H/R group， H/R+ c-RA-pretreated group （100 nmol/L c-RA） and H/R+ c-RA+ HX531-pretreated group （2.5 μmol/L HX531）. We measured the cell viability by MTT （methyl thiazolyl tetrazolium）， apoptosis rate of cardiomyocytes by using flow cytometry ， and mitochondrial membrane potential by JC-1 fluorescent probe， protein levels of Bcl-2， Bax and cleaved Caspase-9 with Western blot. All measurement data were expressed as （x±s） ， and statistically analyzed using One-way ANOVA and Dunnett-t test. Differences were considered significant when P

【Key words】Retinoid X receptor； Cardiomyocytes； Apoptosis； Mitochondria； Hypoxiaq/reoxygenation

在众多核受体中，维甲类X受体（retinoid X receptor，RXR）能与其他众多细胞核受体发生交互作用，对多种生物途径有潜在的多向性效应；RXR不仅和自身形成RXR/RXR同源二聚体，还可以和甲状腺激素受体、维生素D受体、过氧化物酶体增殖活化受体、维甲酸受体等多种核受体形成异二聚体，在细胞增殖、分化、凋亡等方面发挥重要功能[1-2]。笔者前期的工作表明[3]，激动核受体RXR可以抑制过氧化氢诱导的心肌细胞氧化应激损伤，但其中的机制还不是很明确。在此，采用心肌细胞株H9c2建立缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）氧化应激损伤模型，用RXR激动剂9-顺式维甲酸（9-cis retinoid acid，c-RA），RXR拮抗剂HX531干预，观察激动核受体RXR对H9c2细胞H/R损伤的保护作用，及从线粒体水平探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DMEM（高糖）、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清购自美国Gibco公司，台盼蓝、c-RA购自美国Sigma公司，JC-1试剂盒购自美国MP （molecular probes）公司，Western blot印迹检测所用的兔多克隆抗Bax、Bcl-2、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-9及β-肌动蛋白抗体均购自美国Cell Signaling公司，HX531由日本东京大学Dr. Hiroyuki Kagech赠送。

1.2 细胞株及培养

H9c2大鼠心肌细胞株，购自美国典型培养物保藏中心（American type culture collection， ATCC），用含10%胎牛血清高糖DMEM培养基在37℃、5%CO2条件下培养。

1.3 细胞分组

将传代接种于培养板生长24 h的细胞随机分为四组：①健康对照组（N组）：常氧条件下加入0.1%的二甲基亚砜（DMSO）培养6 h；②H/R模型组：缺氧2 h，复氧4 h；③RA组：缺氧前向培养液中加入终浓度为100 nmol/L c-RA预处理1 h；④HX组：在缺氧前加入终浓度2.5 μmol/L HX531预处理0.5 h，再加入终浓度为100 nmol/L c-RA处理1 h。

1.4 缺氧/复氧模型的建立

将处理好的细胞换用经高纯氮气饱和15 min的DMEM培养液，置于低氧（1%O2、5%CO2、94%N2）孵箱中，进行缺氧培养，2 h后换用含氧的无血清DMEM培养基在正常（21%O2、5%CO2、74% N2）孵箱中继续培养4 h，建立H/R损伤模型[4]。

1.5 细胞活力检测

参照笔者既往文献中的方法，用MTT法测量各组经实验药物处理后的细胞活力[3]。

1.6 JC-1流式细胞法检测细胞凋亡比例

线粒体去极化是细胞早期凋亡的标志，通过JC-1定量线粒体膜电位以区分凋亡细胞和非凋亡细胞。收集细胞，加入5 μg/ml JC-1探针 37 ℃ 孵育30 min，温磷酸盐缓冲溶液洗一次，在流式细胞仪中读取细胞凋亡比例[3]。

1.7 JC-1染色检测心肌细胞线粒体膜电位改变

将爬好片分组处理后的细胞，加入10 μg/ml JC-1染色液，37℃孵育15 min，温磷酸盐缓冲溶液洗1次，在激光共聚焦显微镜下（德国Leica，激发波长488 nm）观察拍照；接种于6孔板的细胞处理后，加入5 μg/ml JC-1探针37°C 孵育30 min，上流式细胞仪（FACS Calibur，BD公司），计数10 000个细胞，分别读取红光荧光强度（FL-2通道）和绿光荧光强度（FL-1通道），每孔线粒体膜电位以红色荧光与绿色荧光强度比值表示[5]。

1.8 Western blot印迹法检测蛋白表达

收集经实验处理的细胞，经过细胞裂解、离心，收集全细胞裂解液。用BCA法定量蛋白，取等量的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳、转膜、抗体孵育等步骤后，用免疫印迹化学发光试剂孵育后，X光胶片曝光，曝光显影的目的条带用ImageJ image处理软件进行半定量分析，以内参为参考标准计算出目的条带标准化后的光密度值，并以此判断蛋白的表达水平。

1.9 统计学方法

应用SAS 9.13软件对资料进行分析，所有计量资料以均数±标准差（x±s）表示。采用单因素方差分析法（One Way ANOVA）以推断其组间差异，并在组间差异具有统计学意义，则采用Dennett-t检验进行进一步的分析，包括比较N组与H/R组，H/R组与RA组，RA组与HX组间的数据。以P

2 结果

2.1 MTT法检测细胞活力

本研究发现H/R损伤诱发心肌细胞活力下降（65.7±8.9）%，F =30.11，P

2.2 JC-1流式检测心肌细胞凋亡百分比

流式细胞仪在计数10000个细胞后，根据细胞荧光不同能准确地判断细胞膜电位高低从而达到区分细胞凋亡与否，以凋亡细胞数除以10 000作为凋亡百分比。H/R组凋亡百分比明显增加[（31.60±3.4）% vs （5.3±1.5）%，F=194.6，P

2.3 JC-1染色检测心肌细胞线粒体膜电位变化

如图2A所示，在正常细胞中，线粒体膜电位较高，JC-1染料以多聚体形式存在，发红光为主，在H/R损伤后，部分细胞线粒体膜电位降低，JC-1染料以单聚体形式存在，发绿光为主；在100 nmol/L c-RA预处理组，线粒体膜电位降低不明显，而2.5 μmol/L HX531能阻断c-RA的作用，线粒体膜电位明显降低。图2B表示分别在585 nm和 530 nm下读取的绿光和红光荧光强度，以平均红光荧光强度与绿光平均荧光强度比值表示线粒体膜电位（图2C），H/R组线粒体膜电位比健康对照组明显降低[（2.08±0.21） vs.（ 4.11±0.22），F=144.8，P

2.4 Western blot检测线粒体凋亡通路

Bcl-2家族蛋白是心肌细胞凋亡重要的调节因子，Caspase-9是线粒体凋亡途径的关键蛋白酶，是激活Caspase“瀑布式”反应的启动子。如图3所示，H/R诱导Bcl-2表达下调，Bax表达上调，Bax/Bcl-2比值上升，伴随Caspase-9活化，提示线粒体凋亡通路激活；RXR激动剂能抑制线粒体凋亡通路激活，而这种保护作用被RXR拮抗剂所阻断。说明激动RXR通过作用线粒体凋亡通路抑制H/R诱导的心肌细胞损伤。见图3。

3 讨论

再灌注治疗可以挽救急性心肌梗死患者的缺血心肌，但也能使缺血加重，促使可逆性缺血损伤转化为不可逆性再灌注损伤。探寻心肌缺血-再灌注损伤防治靶点一直是心血管医生重要课题。既往研究表明RXR受体参与胚胎期心脏发育的调控作用，RXRα敲除的胎鼠（RXRα-/-）出现心室腔发育不良，表现为室壁变薄和局部室间隔缺损、心室收缩功能减弱而胎死腹中[6-7]；原因可能与心肌细胞凋亡增加有关[8]，提示RXR信号通路可能参与心肌细胞的增殖、分化以及发育的调控；然而RXR受体参与的心肌细胞氧化应激损伤调控作用鲜有报道[3，9]。本研究采用MTT法和流式法，证实了激动RXR可以抑制缺氧/复氧损伤引起的细胞活力下降和凋亡增加，与笔者前期工作中表明的激动RXR可以抑制过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡相似[3]，但其中机制还不明了。

在哺乳动物中，线粒体占到细胞体积的30%，是能量代谢中心，其功能状态直接决定了细胞的存亡[10]。很多研究显示，在缺血-再灌注中，心肌细胞线粒体结构和功能都受到破坏，包括腺苷酸含量减少、呼吸链功能受抑制、ATP生成减少、氧自由基生成增加等[11]，但其中最重要的一点就是线粒体跨膜电位的破坏，这是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一，发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前。一旦线粒体通透性转运孔非生理性开放，线粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡过程[12]。本研究采用荧光探针JC-1结合流式技术检测线粒体膜电位，JC-1 可透过正常细胞膜以单体状态聚集胞内，正常健康线粒体的膜电位具有极性，JC-1 依赖于线粒体膜电位的极性被迅速摄入线粒体内，并因浓度增高而在线粒体内形成多聚体，多聚体发射光为红色荧光，可被流式细胞仪的红色（FL-2）通道检测到；而细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1 从线粒体内释放，红光强度减弱，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光，可在流式细胞仪绿色（FL-1）通道检测到，分别得到平均荧光强度，以红色/绿色荧光比值代表线粒体膜电位，结果可靠，敏感性高。笔者发现，c-RA可以稳定H/R损伤诱导的线粒体膜电位降低，而这一保护作用又可以被HX531阻断，说明激动RXR受体对心肌细胞的保护作用与稳定线粒体膜电位相关。既往研究显示在某些细胞中[13]，c-RA可以促进RXR表达，并从胞核转位到线粒体，诱导线粒体DNA的转录和翻译，这过程依赖线粒体膜电位的完整性和ATP含量；早期的研究也表明[14]，RXRα-/-突变胎鼠在心肌能量代谢上也存在明显异常，参与脂肪酸β氧化代谢的中链、长链脂酰辅酶A脱氢酶mRNA水平下降，ATP含量减少，说明线粒体功能受损。结合本研究，有理由推断RXR受体与细胞线粒体功能状态存在密切关系，激动核受体RXR可以稳定心肌细胞H/R氧化应激损伤中的细胞线粒膜电位。

为了进一步探讨其中机制，本研究检测了Bcl-2 家族中最重要的两种蛋白（Bcl-2、Bax）表达。研究证明，Bcl-2 家族蛋白成员在细胞凋亡中起重要作用， 它们成员间的相互作用对线粒体介导的细胞凋亡起调控作用，主要的抗凋亡成员Bcl-2在线粒体外膜发挥作用，以维持膜的完整性。相反，主要的促凋亡成员Bax 通过破坏线粒体膜的完整性发挥作用。所以，目前认为线粒体外膜通透性的改变直接由Bcl-2 家族蛋白控制[15]。一方面，Bcl-2 家族蛋白成员精确地定位线粒体外膜上改变线粒体膜的通透性；另一方面，Bcl-2 家族蛋白能够诱导线粒体通透性转变孔道的开放。本研究显示c-RA可以上调Bcl-2蛋白表达，同时下调Bax蛋白表达，而这种作用又被HX531拮抗，说明激动RXR受体对心肌细胞的保护作用可能源于下调Bax/Bcl-2比值，参与调控线粒体凋亡通路有关。

既往研究表明RXR受体参与的细胞凋亡调控在不同细胞起着不同的作用，如在人肾小球膜细胞、T淋巴细胞中[16-17]，激动RXR受体抑制细胞凋亡；而在一些肿瘤细胞中，如肺癌、乳腺癌及白血病中[18-20]，激动RXR受体可以促进细胞凋亡。这种截然不同的作用可能与细胞种类及凋亡刺激物属性相关。

本研究证实激动RXR受体能拮抗H/R氧化应激诱导的心肌细胞损伤，其机制与稳定线粒体膜电位、抑制线粒体凋亡通路有关；从而为防治心肌缺血/再灌注损伤提供新的干预靶点。

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（收稿日期：2013-04-08）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.10.011

基金项目：温州市科技局项目 （Y20100010）；浙江省教育厅项目 （Y200906376）；国家自然基金资助项目（ 81270282、81070176、30600242、81170192）；上海市曙光计划资助项目（12SG22）

作者单位：325000 浙江省温州，温州医科大学附属第一医院心内科（单培仁、黄周青、黄伟剑）；上海交通大学医学院附属仁济医院心内科（卜军）

通信作者：卜军，Email：；黄伟剑，Email：

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