绿色木霉-M1固态发酵产纤维素酶条件研究

摘要 为了用廉价基质生产纤维素酶，对绿色木霉-M1利用稻草和麸皮固态发酵生产纤维素酶的条件进行了研究。结果表明，固态发酵产纤维素酶的较优条件为培养温度28 ℃，料液比为1∶2.5，氮源浓度1.5%，稻草和麸皮比例为7∶3；在此条件下，接种10%液态种子进行培养，酶活力在0～60 h逐渐上升，60～72 h缓慢下降，72 h后酶活重新上升，108 h酶活达最大值。

关键词 稻草秸秆；固态发酵；纤维素酶

中图分类号 TQ929 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2011）12-0049-03

纤维素是可再生能源物质，总产量占地球植物干重的1/3～1/2，植物纤维素因其含量丰富及巨大的潜在利用价值而被认为是一种极有开发前景的原料。因此，纤维素的分解利用对于解决未来的能源危机与环境问题具有十分重大的意义。利用纤维素酶将植物纤维原料水解是合理利用可再生资源的一条有效途径，其关键环节是纤维素酶的生产。纤维素酶在食品、饲料、农副产品加工、印染纺织、制浆造纸、石油开采和资源再生等方面具有广泛的用途和应用前景[1]。

高成本、低收益是限制纤维素酶在工业应用中的主要问题，研究人员在利用廉价的基质进行纤维素酶生产方面做了大量的研究工作，在把注意力放在选育高效降解纤维素的微生物的同时，也十分关注如何改善发酵的过程。固态发酵与液态发酵相比，具有设备投资少、生产成本低等特点。因此，固态发酵技术在纤维素酶生产方面已引起了广泛的重视[2]。该文对绿色木霉-M1固态发酵产纤维素酶的条件进行了优化，对绿色木霉-M1的产酶曲线进行了科学研究，以期为进一步利用廉价基质生产纤维素酶奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料。氨化预处理稻草粉，麸皮（市售）。

1.1.2 菌种。绿色木霉-M1菌株（实验室保存）。

1.1.3 培养基。具体种类如下：①斜面培养基。即PDA培养基。液态种子培养基：马铃薯汁，2%葡萄糖，pH值自然，121 ℃灭菌20 min。②固态发酵产酶基础培养基。稻草粉7 g，麸皮3 g，（NH4）2SO4 0.2 g，水20 mL，pH值自然，121 ℃灭菌50 min。

1.1.4 试剂。盐酸、硫酸、氨水、氢氧化钠、3，5－二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、苯酚、硫酸铵、尿素、蛋白胨、硝酸钠、硝酸铵、氯化铵、无水葡萄糖等试剂均为国产分析纯。

1.1.5 仪器与设备。电热鼓风干燥箱、电子天平、离心机、分光光度计、高压蒸汽灭菌锅、生化培养箱、恒温振荡器、水浴锅、超净工作台等。

1.2 试验方法

1.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制。准确称取100.0 mg分析纯无水葡萄糖（预先在105 ℃烘干至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100 mL容量瓶中，再定容至刻度，摇匀，浓度为1 mg/mL。取8支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL葡萄糖标准溶液，加入2.5 mL DNS试剂混合均匀，在沸水浴中加热5 min，取出后立即用流水冷却到室温，定容至25 mL，摇匀。于520 nm波长处测定OD值，以OD值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线，标准曲线方程为y=0.832 x+0.000 3，R2=0.999 5。葡萄糖标准曲线如图1所示。

1.2.2 DNS试剂配制。称取200 g酒石酸钾钠，溶于一定量水中，加热溶解，添加10.0 g 3，5-二硝基水杨酸、10.0 g氢氧化钠，溶解后加入2 g苯酚、0.5 g无水亚硫酸钠，全部加热溶解后，冷却至室温，定容至1 000 mL。用前一周配制。

1.2.3 固态发酵产酶培养方法。将绿色木霉-M1接种于PDA斜面活化，用接种环挑取一环接种于装有30 mL液态种子培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃ 150 r/min摇床培养72 h；然后接种于装有固态发酵产酶基础培养基的250 mL三角瓶中，混匀后于试验要求的条件下静置培养。

1.2.4 粗酶液的制备。称取1 g发酵后的鲜曲，加10 mL蒸馏水，搅拌，于40 ℃水浴中保温45 min，用脱脂棉过滤，3 000 r/min离心10 min，取上清液即为粗酶液。另取一定量发酵后的鲜曲，80 ℃烘干至恒重，测定水分含量。

1.2.5 FPA、CMC酶活力的测定[3-4]。酶活力单位规定：以每克干物质1 min水解生成1 mg葡萄糖的酶量为1个国际单位（IU，简写为U）[5]。

1.2.6 单因素试验。根据相关文献报道和前期试验，影响绿色木霉-M1固态发酵产纤维素酶的主要因素有稻草和麸皮比例、氮源浓度、料液比、培养温度等，分别对这些影响因素进行单因素试验。

1.2.7 正交试验。在单因素试验基础上进行正交试验，对绿色木霉-M1固态发酵产纤维素酶的条件进行优化，具体设计见表1。

2 结果与分析

2.1 稻草粉和麸皮比例对酶活的影响

改变固态发酵产酶基础培养基中稻草粉和麸皮的比例进行试验，接种10%的液态种子，混匀后于28 ℃静置培养4 d后测酶活，结果见图2。

可以看出，当固态发酵培养基中麸皮含量增大时，固态发酵后所得粗酶液的FPA和CMC酶活逐渐增大，当稻草粉和麸皮比例为7∶3时，FPA和CMC酶活均达到最大。随着麸皮含量继续增加，培养基蓬松程度降低，减少了通气量，影响产酶，FPA和CMC酶活呈下降趋势。

2.2 氮源浓度对酶活的影响

改变固态发酵产酶基础培养基中氮源的浓度，接种10%的液态种子，混匀后于28 ℃静置培养4 d后测酶活，结果如图3。

可以看出，随着氮源浓度的增大，发酵后所得粗酶液的酶活也逐渐增大，但当加入氮源的浓度超过2.0%时，所得粗酶液的酶活缓慢下降。氮源浓度过低，不能满足菌体生长，氮源浓度过大，对产酶有一定的抑制作用。

2.3 料液比对酶活的影响

改变固态发酵产酶基础培养基中的料液比，接种10%的液态种子，28 ℃静置培养4 d后测酶活，结果见图4。

可以看出，水分含量过低时，菌体生长得不到充足的水分，不利于菌体的生长，发酵后所得粗酶液的酶活较低；水分含量过高时，影响氧的传送，会抑制菌体生长，因而粗酶液的酶活也较低。当料液比为1∶2.5时，固态发酵所得粗酶液的酶活最大。

2.4 培养温度对酶活的影响

以固态发酵产酶基础培养基为产酶培养基，接种10%的液态种子，摇匀后分别置于24、26、28、30、32 ℃静置培养4 d后测酶活，结果见图5。

可以看出，温度过低不利于菌体的生长，温度过高也会限制菌体的生长。培养温度为28 ℃时，所得粗酶液的酶活最高。

2.5 正交试验结果

根据正交试验表的设计方案，改变固态发酵产酶基础培养基的组成和培养条件，接种10%的液态种子，摇匀后静置培养4 d测酶活，结果见表2。

由表2可知，绿色木霉-M1固态发酵产FPA酶的较优条件为D2A2B3C3，即培养温度28 ℃，稻草和麸皮比例为7∶3，氮源浓度为2.5%，料液比为1∶3；绿色木霉-M1固态发酵产CMC酶的较优条件为D2C2B1A1，即培养温度28℃，料液比为1∶2.5，氮源浓度1.5%，稻草和麸皮比例为8∶2。综合考虑FPA和CMC酶活2个指标，绿色木霉-M1固态发酵产纤维素酶的较优条件为D2C2B1A2，即培养温度28℃，料液比为1∶2.5，氮源浓度1.5%，稻草和麸皮比例为7∶3。

2.6 培养时间与酶活的关系

根据正交试验结果，对于固态发酵产酶基础培养基，设定如下条件培养：温度28 ℃，料液比为1∶2.5，氮源浓度1.5%，稻草和麸皮比例为7∶3，液态种子接种量为10%的液态种子，pH值自然。从培养0 h开始，每隔12 h测定FPA和CMC酶活，培养时间与酶活的关系见图6。

由于麸皮中含有多种维生素和微生物所必须的生长因子，在发酵开始的0～60 h，绿色木霉-M1利用麸皮产生纤维素酶，60 h后麸皮中的营养物质几乎被消耗殆尽，绿色木霉-M1开始利用稻草粉产生纤维素酶，由于从利用麸皮到利用稻草粉之间需要适应的过程，因而在60～72 h内纤维素酶的活力下降，绿色木霉-M1适应在稻草粉上生长后，纤维素酶的活力又开始上升，在108 h时酶活力达到最大值。随着生长时间的延长，一方面，酶解产物对纤维素酶产生了抑制作用；另一方面，由于菌体逐渐衰老，导致酶活力开始下降。

3 结论

对绿色木霉-M1固态发酵产纤维素酶的条件进行了研究，结果表明：绿色木霉-M1固态发酵产纤维素酶的较优条件为培养温度28 ℃，料液比1∶2.5，氮源浓度1.5%，稻草和麸皮比例为7∶3。绿色木霉-M1在固态发酵产纤维素酶的0～60 h，利用麸皮产生纤维素酶，60 h后麸皮中的营养物质被利用完，开始利用稻草粉产生纤维素酶，在60～72 h内纤维素酶酶活下降，72 h后，纤维素酶酶活又开始上升，在108 h酶活力最高。纤维素是地球上数量最大的可再生资源，其生物转化与利用对解决当前世界面临的能源危机、粮食短缺和环境污染等问题具有非常重要的意义，随着研究工作的不断深入开展，纤维素酶的应用领域将越来越广。

4 参考文献

[1] KANG S W，PARK Y S，LEE J S，et al.Production of cellulases and hemicellulases by Aspergillus niger KK2 from lignocellulosic biomass[J]. Bioresource Technology，2004，91（2）：153-156.

[2] CHAHAL P S，CHAHAL D S，LEG B B.Production of cellulose in solid-state fermentation with Trichoderma reesei MCG 80 on wheat straw[J].Applied biochemistry and biotechnology，1996：57-58，433-442.

[3] HARDIN M T，MITCHELL D A，HOWES T.Approach to designing rota-ting drum bioreactors for solid-state fermentation on the basis of dimens-ionless design factors[J].Biotechnology and Bioengineering，2000，67（3）：274-282.

[4] GHOSE T K.Measurement of cellulose activities[J].IUPAC Pure & Appl Chem，1987，59（2）：257-268.

[5] STUART D M，MITCHELL D A，JOHNS M R，et al.Solid-state fermen-tation in rotating drum bioreactors：operating variables affect performance through their effects on transport phenomena[J].Biotechnology and Bioe-ngineering，1999，63（4）：383-391.