脂肪干细胞在皮下软组织充填中的研究进展

洪晓娅 综述，徐靖宏 审校

[摘要]脂肪干细胞(Adipose-Derived Stem CellsADSCs)具有一般干细胞的特点，即多向分化潜能和稳定的体外多代增殖能力，其免疫相容性好，来源丰富，易于获得，可反复取材，无伦理学问题，作为组织工程的种子细胞有着非常重要的实际研究和应用价值。本文着重对脂肪干细胞在生物学特性、体外成脂诱导分化,以及与之相配的生物学载体支架方面的最新进展进行阐述。

[关键词]脂肪干细胞；诱导分化；载体支架

[中图分类号]R622[文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2008）10-1540-03

Application of adipose tissue-derived stem cells in subcutaneous soft tissue filling

HONG Xiao-ya，XU Jing-hong

（Department of Plastic Surgery,the First Affiliated Hospital,College of Medicine,

Zhejiang University,Hangzhou 310003,Zhejiang,China）

Abstract: Adipose tissue is an abundant, accessible, and replenishable source ofstem cells. Adipose-derived stem cells(ADSCs) can be isolated from liposuction waste tissue by collagenase digestion and differential centrifugation. They are multipotent, differentiating along the adipocyte, chondrocyte, myocyte, neuronal, and osteoblast lineages. ADSCs cells have potential applications for the filling of subcutaneous soft tissue. Additional pre-clinical safety and efficacy studies will be needed before the promise of these cells can be fully realized.

Key words:ADSCs; differentiate;support

皮下软组织充填一直是整形外科常见的治疗手段，对于体表的皮下软组织欠丰满、凹陷、萎缩畸形目前常采用自体游离脂肪或各种人工材料进行充填。人工材料因存在排异、创伤大及安全性等问题难以满足临床需要，而自体游离脂肪的移植成活率仅为40%～50%，这使得其临床应用受到很大限制。脂肪移植物被吸收的原因之一是成熟脂肪细胞对缺氧、损伤的耐受力低，且不能增殖更新[1]。而脂肪干细胞（ADSCs）则具有强大的增殖分化潜力，对缺氧耐受力更强，且自体干细胞用于移植可避免排异反应，更加安全。2001年Zuk[2]等从脂肪细胞抽吸物中成功分离培养出具有骨、软骨、脂肪、肌肉等多向分化潜能的细胞，cronthos[3]等于同年也证实脂肪来源细胞中的确存在具有间充质干细胞特性的细胞。2002年Zuk[4]等又证实了人的脂肪组织是多能干细胞的一个来源，具有分化为所有中胚层起源细胞的能力，还可分化为部分内外胚层起源的细胞，自此脂肪干细胞(ASCs)以其来源丰富、易于获得、能在体外多代稳定增殖、具有多向分化潜能、免疫相容性好、取材对患者损伤小等优点而日益成为研究热点。现将其成脂诱导及诱导后复合生物支架材料用于软组织填充修复研究现状综述如下。

1取材、提取、体外扩增

取材部位最好能配合患者身体塑形的需要，做到一举两得。平均每300ml脂肪组织可获得2×lO8～6×l08个干细胞，从不同个体的脂肪抽吸组织中提取的平均脂肪干细胞数目有所不同，但从同一个体不同部位的脂肪中所获得的干细胞数目却比较近似。患者年龄越大，成脂分化率越低，同一患者不同部位来源的脂肪抽吸组织中的脂肪干细胞在成脂诱导分化能力上存在差异[5]。

目前常采用电动负压吸脂术或注射器手工抽脂术获取无菌脂肪组织，一般认为注射器手工抽取的脂肪损伤较小。利用分层纯化法将脂肪混合物静置片刻，分别去除上下两层。将获得的脂肪用PBS缓冲液洗4次，以去除红细胞和细胞碎片。清洗后用适量的0.075%胶原酶Ⅰ在振动器37℃下消化1h。胶原酶Ⅰ活性用等量DMEM(含10%的胎牛血清)中和，后离心1200转(10min)，细胞即被悬浮在DMEM中，用100目筛网过滤，离心10min以沉淀细胞，重新悬浮细胞加至培养瓶，在37℃、CO2孵箱中培养24h，更换培养液将未贴壁细胞和残渣被除掉。后每周换液2次，达到对数生长期后，用0.25胰酶37℃消化，按1:3的比例进行传代。体外扩增10代，平均每代倍增数目为1.59±0.224，累计倍增数目为15.53[6]。消化所得细胞除用于延续培养和进行相关实验外，其余可按照一般方法冻存。冻存后6个月内，以37℃水浴快速复苏细胞，接种于培养皿中可继续传代扩增。

脂肪干细胞至少能保持20代的传代活性，且细胞倍增时间与年龄呈正相关，即年轻人较年老者的脂肪干细胞具有更强的增殖能力[7]。自分泌成纤维细胞生长因子2（FGF-2）对于人体脂肪干细胞的自我增殖具有关键性意义[8]。脂肪干细胞在体外的倍增时间按照培养基的类型和传代数目的不同大致为2～4天[9]，且在传代中保持其端粒酶的长度[10]。但也有报道称端粒酶在递进式传代过程中会逐渐失去活性并缩短[11]。此类研究涉及ASCs移植的安全性问题，有报道称观测到人类ASCs在经历长期传代（>4个月）后发生恶变[12]。提示对于ASCs移植必须建立一套严格的安全性检测体系，其中应包含染色体组型测定。

2ASCs生物学特性

从肉眼上脂肪组织可被区分为，骨髓内脂肪、棕色脂肪、脂肪、机械充填脂肪、白色脂肪等至少5种类型。每种脂肪各自具有不同的生物学特性及功能。因各类脂肪皆有内分泌功能可分泌瘦素、抵抗素等激素参与全身生理调节，脂肪组织做为整体目前倾向于被认为是一个内分泌器官。从人脂肪组织中提取的ASCs，以DMEM培养，流式细胞仪检测表面抗原，以集落形成能力和群体倍增时间来评估增殖潜力，油红0染色来观察ASCs经成脂诱导后中性脂类的蓄积，发现ASCs表达CD44、CD73、CD90、CD105，不表达 CD14、CD31、CD45，具有很高的增殖潜力和多向分化潜能，且良好的免疫相容性类似于BMSCs[13]。中性脂肪干细胞形态以梭形为主，CD11b、CD45、CD49d、CD80、CD86表达阴性，MHC I、MHC lI表达弱阳性，CD29、CD44、CD54的表达阳性。第l1代以前的脂肪干细胞有较强的活力和增殖能力，体外培养至第10代，其细胞仍稳定为二倍体核型BrdU可标记其核。说明ASCs具有较强的自我更新能力，其形态和表面标志均类似于BMSCs[14]。基于流式细胞仪分析和逆转录多聚酶链反应研究，发现hADAS细胞不表达一些其它干细胞群表达的蛋白质，包括端粒末端转移酶、CD133、膜转运ABCG2[15]。另有研究对三种来源（骨髓、脐血、脂肪组织）的干细胞在分离成功率、增殖能力、分化潜力、免疫表型等方面进行比较，发现三种来源的干细胞在组织形态和免疫表型上无显著差异，而在其他生物学特性方面差异明显，如脂肪来源的干细胞增殖能力明显强于另外两者，脐血来源干细胞增殖能力最弱且不具备向脂肪组织分化能力 [16]。相关研究还表明ASCs较BMSCs具有更好的遗传稳定性[17]。

3体外诱导分化

ASCs具有多向分化潜能，不仅能分化为中胚层细胞，如脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞，还能分化为外胚层及内胚层细胞,如神经细胞、肝细胞等。目前尚无标准诱导方案，也都未能得到成熟细胞。由于脂肪组织常用于皮下软组织充填，故将成脂诱导情况总结如下：

成脂诱导培养基1：高糖(含25 mmol/L D-葡萄糖)－DMEM、10%FBS（胎牛血清）、1μmol/L地塞米松、100μmol/L IBMX（异丁甲基黄嘌呤）、5μmol/L胰岛素和60μmol/L吲哚美辛。

成脂诱导培养基2：高糖-DMEM、10%FBS、1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L IBMX、10μmol/L胰岛素、200μmol/L吲哚美辛、100U/ml链霉素、100U/ml青霉素。

成脂诱导培养基3：高糖－DMEM、10%胎牛血清、0.5mmol/L IBMX、1μmol/L地塞米松、10μmol/L胰岛素、1%青链霉素原液。

各方案大同小异，经2周的诱导后，用油红染色鉴定细胞内皆有脂滴聚集，但都未能得到成熟脂肪细胞。如果同时用DMEM/MCDB培养基，发现较α-MEM培养基更有利于细胞的增殖和分化[18]。过氧化物酶增殖物活化受体和C/EBP家族，两者是控制脂肪细胞分化的中心环节[19]。

一般而言，利用脂肪干细胞充填皮下软组织，实验设计皆为在体外用以上培养基诱导至一定阶段后再复合支架材料植入体内，细胞移植成功率为50%～80%不等。因其移植成活率较低且不稳定，尚未达到临床应用要求水平，有学者设想可在体外模拟体内微环境诱导干细胞进一步分化成熟从而提高移植存活率。也有意见认为分离得到的干细胞无需体外诱导，直接复合支架植入体内，体内的微环境即可自行确定分化方向并可能以此提高移植细胞存活率，以上观点均需进一步的实验验证。

4载体支架材料

组织工程技术主要包括生物材料载体、种子细胞及讯息因子。理想的生物载体材料应具有良好的生物相容性，对细胞和组织等无毒性，能以适当速度被吸收降解，强度适中，利于细胞生长和周围组织长入。因不同材料对细胞的生长分化和黏附均有不同的影响，不同的细胞对支架的要求也不尽相同，因而种子细胞能否在支架材料上良好生长并表达自身特异取决于二者的适配程度。

理论上讲，可用于复合脂肪干细胞的生物支架按材料分为三大类：①天然生物材料，如胶原、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素等，此类材料以仿生原理模拟细胞外基质组成；②合成生物材料，如聚乳酸、聚乙醇酸、聚（乳酸－乙醇酸）共聚体等，此类材料具有的优势为可控的降解性；③复合生物材料，为两种或多种天然生物材料或（与）合成生物材料复合而成，具有仿生及可控性的多元优势。按支架的构建方式可分为：三维多孔支架，如PLA多孔支架、胶原/壳聚糖多孔支架，可广泛应用于多种细胞及干细胞的复合移植；凝胶填充支架，如水凝胶填充支架，可用于软骨等的修复；薄膜支架，多用于血管的修复重建；微粒支架，如PLLA微粒支架等。对于支架的生物相容性研究，也经历了生物惰性材料、可调控细胞行为功能的生物活性可吸收材料、具有激活机体再生潜能的组织诱导型生物材料等发展阶段。

目前脂肪干细胞复合支架移植仍处于动物实验阶段，移植后细胞生长变化过程及相关影响因素尚不十分清楚，所用材料主要以天然生物材料为主，与新型组织诱导型材料复合的研究较少，移植存活率不同实验结果相差很大，其最适材料仍有待于进一步研究与选择。

有研究者将ADSc与海绵状透明质酸支架材料复合，经体外成脂诱导后有脂质蓄积，检测到脂肪形成的标志酶甘油-3-磷酸脱氢酶[20]。Stosich[21]等将诱导得到的脂肪细胞分为6组，每组6份样品，第一组将细胞植入圆柱形水凝胶，外层用乙烯－乙二醇多聚体包裹；第二组只将细胞植入水凝胶；第三组将细胞植入多孔胶原海绵；第四组单用无细胞水凝胶；第五组只用细胞；第六组只用无细胞胶原海绵。将六组全部植入无胸腺小鼠4周，结果所有有支架的组都有实质脂肪组织生成，其中第一组效果最好，保有量最高，几乎100%的细胞量次被保留，而第二组的细胞量次保留程度只有35%～65%，证明了预先定形的支架可最大限度地维护植入细胞的存活数量。

5需解决的问题

关于脂肪干细胞的应用，目前仍有许多重要问题有待探索、解决。首先脂肪干细胞在无免疫力的移植受体上表现出的肿瘤样无限增生特性，在进入临床实验前仍需寻找并建立合适的动物模型进行长期观测以确定其移植后安全性。其次，在批量提取生产脂肪干细胞的过程中，如何保障细胞质量的均一稳定仍然有待进一步研究。

综上所述，ASCs具有来源丰富、易于获得、具有多向分化潜能、免疫相容性好、可反复取材、对患者损伤小等优点，相较BMSCs具有更加强大的体外多代增殖能力，相较胚胎干细胞而言可避开伦理学问题。取材时可结合美容塑形的要求取得一举两得的效果。因此是可利用的种子细胞，有望在一定条件下，定向诱导分化为脂肪细胞，提高自体脂肪移植存活率，达到临床治疗目的。

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[收稿日期]2008-07-11[修回日期]2008-10-08