牙周炎发生时外周血中CD4+CD25+T细胞表达的变化研究

【摘要】 目的：探讨CD4+CD25+Treg在牙周炎发生时的免疫调节作用。方法：选择35只成年SPF级Wistar大鼠，丝线结扎加高糖饮食建立大鼠牙周炎发生的动物模型，获得类似牙周炎自然病程的连续组织标本，病理切片确定病损，分别获取第4、8、12、16周的大鼠外周血，术前未结扎组对照。以流式细胞仪检测不同时段外周血中CD4+CD25+Treg的比例变化。结果：建立了Wistar大鼠牙周炎发生的动物模型，病理切片确定了牙周病损的存在。结果显示伴随牙周炎发生的牙槽骨的吸收逐渐增多。流式细胞仪结果显示结扎后第4、8、12、16周外周血中CD4+CD25+Treg占CD4+T细胞的比例为7.70%、9.12%、9.74%、10.31%，与术前比较差异均有统计学意义（P

【关键词】 牙周炎发生； CD4+CD25+T细胞； 免疫调节

CD4+CD25+Treg的免疫调节作用已经成为免疫学研究的前沿课题，并取得了令人瞩目的进展[1]。研究表明：CD4+CD25+Treg作为一个具有独立功能的T细胞亚型，在维持免疫系统平衡过程中有着不可代替的作用[2]。在机体自我耐受、抗肿瘤、抗感染等重要免疫功能方面起着中心作用[3-4]。目前CD4+CD25+Treg在牙周炎发生时的免疫调节作用的研究仍较少。本研究动态观察处于牙周炎发生不同时期的外周血中CD4+CD25+Treg的比例变化，探讨CD4+CD25+Treg在牙周炎发生时的免疫调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料 35只成年SPF级Wistar大鼠，体重300～350 g，雌雄各半，购于山东大学实验动物中心。CD4-FITC抗体、CD25-PE抗体、PE-IgG1及FITC-IgG1同型对照抗体均购于美国eBioscience公司，流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 大鼠牙周炎模型的建立 氯胺酮腹腔注射（100 mg/kg）麻醉下，采用直径为0.2 mm的正畸钢丝分别从双侧下颌舌侧穿过磨牙间隙，环绕第一磨牙牙颈部结扎。术后采用高糖饲料（蔗糖56 g、脱脂奶粉28 g、面粉6 g、酵母粉4 g、肝粉1 g、少量食盐和新鲜蔬菜）和200 g/L高糖水进行喂养，术后4、8、12、16周，随机抽取以上各7只，氯胺酮腹腔注射麻醉下肉眼观察牙周组织变化，并做临床检查，探诊出血及牙周袋探诊，制作下颌磨牙牙体牙周标本。术前未结扎组7只为对照。

1.3 观察指标 （1）龈沟出血指数（sulus bleeding index， SBI）：大鼠处死前，用探针轻探选用牙的牙周袋或龈沟10 s，不出血为0，出血为1。（2）探诊深度（probing depth， PD）：大鼠处死后，用牙周探针探选用牙的牙周袋，每牙选近中颊、颊侧、远中颊3个点测量，取均值。（3）牙槽骨吸收值（alveolar bone loss， ABL）：大鼠处死取牙龈组织标本后，在4倍体视显微镜下测量从釉牙骨质界到牙槽骨嵴顶的长度，每牙选近中舌、舌侧、远中舌3个点测量，取均值。（4）组织学观察：用新鲜配制的多聚甲醛溶液行心脏体外循环内灌注，多聚甲醛液固定，混合酸脱钙梯度乙醇脱水，石蜡包埋，常规染色光镜下观察。

1.4 流式细胞仪检测 每只大鼠心脏采血（约0.5 mL），储存于EDTA抗凝管中，放置于4℃冰箱待测。加外周血50 μL至检测管和对照管中；分别加入Anti-RatCD4-FITC 1 μL、Anti-RatCD25 Percp-eFluor710 0.5 μL和MouseIgG1kIsotype controlPercp-eFluor710 0.5 μL，混匀，室温下暗处放置15 min；加0.5 mL新鲜准备的固定/破膜液，混匀，4 ℃冰箱放置45 min；加2 mL新鲜配制的1×破膜液，1800 r/min离心5 min，去上清，混匀；重复1次；加Anti-Mouse/RatFoxp3-PE和RatIgG2akIsotypecontrol-PE 5 μL，混匀，4 ℃冰箱放置30 min；加1 mL 1×破膜液1800 r/min离心5 min，洗涤1次；加0.5 mL1%多聚甲醛重悬，上流式细胞仪分析。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0软件包对各组数据进行统计学处理，组间比较采用独立样本t检验，以P

2 结果

2.1 大鼠牙周炎模型的建立 建立了Wistar大鼠牙周炎发生的动物模型；体视显微镜下观察骨的吸收情况，测量从釉牙骨质界到牙槽骨嵴顶的长度，每牙选近中舌、舌侧、远中舌3个点测量，取均值，牙周炎发生的牙槽骨的吸收逐渐增多。见图1。

图1 牙槽骨吸收量

2.2 牙周炎发生不同时期CD4+CD25+调节性T细胞的表达变化 流式细胞仪结果显示结扎后第4、8、12、16周，外周血中CD4+CD25+Treg占CD4+T细胞的比例为7.70%，9.12%，9.74%，10.31%，与术前比较差异均有统计学意义（P

图2 不同时期CD4+CD25+调节性T细胞的表达改变

3 讨论

CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）作为调节性T细胞中最为重要的一群[5]。天然的CD4+CD25+T细胞主要来源于胸腺，这部分称为固有性CD4+CD25+T细胞，其产生于胸腺，然后迁移到外周发挥作用，CD4+CD25+Treg胸腺细胞与外周的CD4+CD25+Treg一样，表现对经由TCR的抗原刺激呈低反应性，并且显示抑制其他T细胞增殖的能力。这些在胸腺发育成熟后进人外周淋巴组织CD4+CD25+Treg，主要在预防病理性自身免疫反应方面起作用[6]。在外周，有抗原刺激（如TGF-β）或免疫抑制因子（如IL-10）诱导的条件下，成熟T细胞也可分化CD4+CD25+Treg，这部分称适应性CD4+CD25+Treg主要在微生物感染和移植免疫中起作用。

CD4+CD25+Treg在许多感染性疾病，尤其是在慢性持续感染中均存在免疫抑制作用[7-8]。这种免疫抑制作用有利于病原体存活，但同时也避免了机体过度免疫应答所产生的病理损害。RA是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，其发病机制尚不清楚。近年来人们发现CD4+CD25+Treg与RA密切相关。与正常小鼠相比，通过注射抗CD25的单抗去CD4+CD25+Treg的小鼠胶原性关节炎更重，抗Ⅱ型胶原抗体的浓度更高。主动转移CD4+CD25+Treg细胞后，可以明显减缓疾病进展，明显降低关节炎的严重程度，而且主动转移后不久即可在炎症性滑膜处发CD4+CD25+Treg，从而说明调节作用在关节局部发生[9]。本研究结果表明，伴随大鼠牙周炎病损的确立外周血中CD4+CD25+Treg比例逐渐升高，机体通过调节CD4+CD25+Treg控制炎症免疫的发生。

参考文献

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（收稿日期：2013-07-29） （本文编辑：黄新珍）