杜仲叶抗氧化和黄酮量的研究

本文作者：向灿辉 邓镇涛 王文君 陈阳 孙志勇 陈开龙 单位：遵义医学院珠海校区生物工程

杜仲（EucommiaulmoidesOliv)为我国的名贵药用植物，具有多种药理作用。传统以皮入药，现代研究证明，杜仲叶和杜仲皮所含化学成分及药理效应基本相同，近年的研究集中于杜仲有效成分的提取及含量测定研究[1-3]。现代研究发现，杜仲叶中主要含有环烯醚萜类化合物，木脂类化合物，苯丙素类化合物，黄酮类化合物，多糖等，具有抑菌消炎，抗氧化，抗衰老，抗癌防癌等诸多功效[4-7]。而杜仲茶（杜仲叶水提物）在日本广泛用来作为一种功能性食品用于高血压的治疗，据日本厚生省统计表明，杜仲在日本针对高血压病的健康食品中消费额排名第一。最近几十年，越来越多的证据表明，自由基活性的增强是各种临床疾病发生的原因，而机体自由基数量的增加大多是由于机体抗氧化系统能力的下降。开发和研制天然植物抗氧化剂，消除氧自由基对机体的损害作用，是目前医药和食品研究中的一个重点[8]，其中对黄酮类化合物的研究是天然抗氧化剂研究中的热门领域之一[9-10]。利用溶液浸提结合超声波方法提取杜仲叶总黄酮，以VC和芦丁为对照，采用DPPH法和FRAP法，对杜仲叶提取物的抗氧化活性与总黄酮浓度的相关性进行了研究，在传统方法的基础上，引入了时间参数，从而能更加准确地衡量天然产物的抗氧化活性。

1试验试剂

芦丁标准品，购自成都曼思特生物科技有限公司；维生素C，中国医药集团上海化学试剂公司；杜仲叶提取物，自制；1,1-二苯基-2-苦味肼基自由基DPPH•试剂，美国Sigma-Aldrich公司；TPTZ试剂，美国Sigma-Aldrich公司；其它试剂均为分析纯。

2试验方法

2.1芦丁标准曲线的绘制[11-12]精密称取芦丁25mg，置于100mL容量瓶中，用体积分数为60%的乙醇溶液定容至刻度，摇匀，取25mL用蒸馏水稀释至50mL（0.125mg/mL），分别准确吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL于10mL容量瓶中，加质量分数5%NaNO20.3mL，摇匀静置6min，加质量分数10%Al(NO3)30.3mL摇匀静置6min，再加1mol/LNaOH溶液4.0mL，用体积分数60%乙醇定容为10mL，此时芦丁的质量浓度依次为0.0125，0.025，0.0375，0.05，0.0625mg/mL，摇匀静置15min，用60%乙醇作空白，在300nm~800nm波长范围内扫描，选择最佳吸收峰波长，并在此波长下作工作曲线。

2.2杜仲叶总黄酮的提取及含量测定精称200g经烘干粉碎后过80目筛的杜仲叶粉，按液固体积比5:1加入石油醚浸提12h后超声波提取1h，过滤收集滤渣，重复操作一次；取滤渣按液固体积比10:1加入体积分数50%乙醇浸提过夜后超声波提取1h，过滤收集滤液，重复操作两次；合并滤液，减压真空浓缩到200mL，得杜仲叶提取液，吸取提取液按2.1中的显色方法测定吸光度值，代入芦丁标准曲线计算提取液总黄酮的量。

2.3抗氧化试验方法

2.3.1对DPPH•的清除作用DPPH•是一种稳定存在的有机自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在特定波长处有强吸收，当加入抗氧化剂后吸收峰下降，下降程度直接反映样品清除自由基能力的大小[13]。各物质对DPPH•的清除能力大小是其抗氧化能力强弱的评价指标之一，可用清除率表示，清除能力高则抗氧化能力强[14]。称取2.5mgDPPH•用无水乙醇定容至100mL，质量浓度25μg/mL，现用现配。移取0.00，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00mL上述标准溶液定容至10mL，无水乙醇为空白，在515nm处测定吸光度，绘制工作曲线。精密称取5mgDPPH•置于100mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度摇匀作为待测液。用无水乙醇分别配制质量浓度为0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2mg/mL的杜仲叶提取液（以总黄酮计），芦丁，VC溶液作为DPPH•检测液。将上述DPPH•待测液2mL和各检测液2mL充分混匀，以乙醇作空白，在515nm测定不同时间的吸光度值。按式(1)计算：清除率=(A空-A样/A空)100%（1）得到各物质清除率。以考察不同样品不同浓度对DPPH•清除率随时间的变化关系。

2.3.2FRAP法[15-16]Fe3+-三吡啶三吖嗪（Ferric-tripyridyl-triazine，Fe3+-TPTZ）可被样品中还原物质还原为Fe2+，呈现出明显的蓝色，并于特定波长处有最大吸收峰，由吸光值可计算样品总的抗氧化能力。FRAP工作液的配制：300mmol/L醋酸盐缓冲溶液（pH3.6）；再配制10mmol/LTPTZ的40mmol/L的盐酸溶液，20mmol/L的FeCl3溶液。上述三种溶液按体积比10:1:1混合加热至37℃，备用。FeSO4•7H2O溶液（0.0278gFeSO4•7H2O用超纯水配液至100mL，浓度为1mmol/L），将其配制成浓度为0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mmol/L的铁标液各10mL，备用。量取上述铁标液各0.1mL，加入FRAP工作液3mL，混匀37℃反应完全用超纯水作空白，于400~800nm扫描得到最大吸收波长，于此波长处测定各吸光度值，绘制标准曲线。分别用超纯水配制质量浓度为0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1mg/mL的样液，芦丁，VC溶液作为FRAP检测液。分别量取0.1mL检测液，加入3mLFRAP工作液，混匀后用超纯水调零，在最大吸收波长处测定其在37℃反应不同时间的吸光度值，代入FeSO4标准曲线换算成当量FeSO4值，以对不同样品的不同浓度对Fe3+的还原能力随时间的变化关系进行比较研究，样品的当量FeSO4值越大表示其还原能力越强。

3结果

3.1杜仲叶提取物中总黄酮含量的测定采用硝酸铝显色法，以511nm为最大吸收波长测定一系列芦丁标准品溶液的吸光度值，得到芦丁的回归方程为y=13.184x-0.0032，R=0.9997。测定杜仲叶提取液稀释液后的吸光度，根据标准曲线及稀释倍数测得杜仲叶总黄酮提取率为46.16mg/g。

3.2DPPH•清除能力DPPH•的标准曲线为：A=0.0317c-0.007，R=0.9997，c是DPPH•的质量浓度（μg/mL），A是吸光度，R是相关系数，从相关系数值可以看出，线性关系很好，可用于定量分析。DPPH•清除率=(A空-A样/A空)100%（2）其中A空为DPPH•待测液的吸光度值，A样为自由基清除过程中某一时刻的吸光度值。从图1可看出，在清除DPPH•试验中，所有样品对DPPH•的清除作用都随浓度升高逐渐而增强，在浓度为0.1mg/mL时，芦丁与VC对DPPH•清除率均在90%以上，杜仲叶提取物对DPPH•清除率也在85%以上。由此可看出，杜仲叶提取物对DPPH•有较强的清除能力。为了更好的比较各个样品的抗氧化能力，以DPPH•被消耗掉50%所需各种抗氧化剂的用量（半抑制量EC50）来表征。结果如下：VC的EC50为0.009mg/mL，芦丁的EC50为0.012mg/mL，杜仲叶提取液的EC50为0.022mg/mL。EC50越小，清除自由基的能力越强，因此各样品清除DPPH•能力为：VC＞芦同时，将芦丁和杜仲叶提取物总黄酮浓度与DPPH•清除率分别进行统计回归，结果如图2所示，还原能力与芦丁及总黄酮在一定浓度范围内具高相关性，线性回归方程分别为y=4307.9x-0.2131，R=0.9972（芦丁）；y=2252.2x+0.7564，R=0.9991（杜仲叶提取物中总黄酮）。另外我们也对各样品不同浓度的DPPH•清除率随时间变化进行了研究，如图3~图5所示，结果表明VC清除自由基的速度很快，为快速抗氧化剂。向DPPH•溶液中加入VC后DPPH•清除率迅速上升，高浓度时1min左右即达到稳定，即使是浓度低至0.005mg/mL时，3min左右也能达到稳定，随着时间的延长DPPH•清除率变化很小。且VC加入量从0.005mg/mL增大到0.05mg/mL时，DPPH•清除率升高的幅度很大，继续提高VC的浓度，DPPH•清除率升高的幅度无明显变化。加入0.1~0.2mg/mL的芦丁溶液后DPPH•清除率20min后才基本稳定，而低浓度时，对DPPH•的清除率20min后仍然未稳定；加入总黄酮量为0.02~0.1mg/mL的杜仲叶提取液后，DPPH•清除率在5min左右基本达到稳定，当总黄酮量为0.2mg/mL时，DPPH•清除率在3min左右基本达到稳定，说明杜仲叶总黄酮抗氧化速度小于VC但大于芦丁，是一个中速抗氧化剂。

3.3FRAP抗氧化试验结果紫外扫描得铁标液加入FRAP工作液显色后的最大吸收波长为593nm，于此波长测定各标准溶液吸光度值，得硫酸亚铁的标准曲线为y=0.5676x+0.1397，R=0.9996，所得结果线性良好，方法可靠。根据FeSO4标准曲线和FRAP待测液加入FRAP检测液后测定的吸光度值，计算出样品的当量FeSO4。当量FeSO4的大小在一定程度上反应了检测物的总还原能力，当量FeSO4值越大表示其还原能力越强[13]。由图6可得，芦丁及杜仲叶提取物对铁离子的还原能力与芦丁及总黄酮浓度（在质量浓度为0.01~0.1mg/mL范围内）呈良好的量效关系，线性方程分别为y=9.2156x+0.0421，R=0.9990（芦丁）；y=9.5672x+0.2432，R=0.9927（杜仲叶提取物中总黄酮）。VC对铁离子的还原能力在质量浓度为0.01~0.06mg/mL范围内有线性关系，方程为y=19.502+0.1758，R=0.9997。采用相对比较方法，对应0.5mmol/L当量FeSO4各样品的浓度分别为：芦丁浓度0.050mg/mL；杜仲叶提取物中总黄酮的浓度0.027mg/mL；VC的浓度0.017mg/mL；浓度越小，抗氧化能力越强，所以各个样品的相对抗氧化能力为：VC＞杜仲叶提取物＞芦丁。我们也对不同样品浓度对Fe3+还原作用随时间的变化进行了比较研究，如图7~图9。结果显示VC为快速抗氧化剂，向FRAP工作液中加入VC后当量FeSO4迅速增大，1min即达到稳定，随着时间的延长当量FeSO4变化很小。增加VC加入量，当量FeSO4明显升高。而芦丁和杜仲叶提取物加入FRAP工作液中后，当量FeSO4随加入量增加也同样迅速增加，但均未能达到平衡，30min后仍有明显的升高，但在单位时间里杜仲叶提取物对应的当量硫酸亚铁升高幅度明显大于芦丁，说明杜仲叶总黄酮的抗氧化速度小于VC而大于芦丁。

4讨论

采用了两种试验模型，结果表明在DPPH•模型中，自由基清除作用强度顺序为VC＞芦丁＞杜仲叶提取液，而在FRAP模型中，对铁离子的还原能力强度顺序为VC＞杜仲叶提取物＞芦丁，VC为公认的强抗氧化剂，抗氧化能力最强。杜仲叶提取物中的黄酮类物质对Fe3+-TPTZ的亲和力可能大于DPPH•，故在两种模型中表现出不同的抗氧化能力。而抗氧化速度顺序均为VC＞杜仲叶提取物＞芦丁。

5结论

杜仲叶提取物与芦丁及VC的对照试验表明：杜仲叶总黄酮具有较强的抗氧化能力，能较好的清除DPPH•，清除率小于VC和芦丁；而对铁离子的还原能力小于VC而大于芦丁；抗氧化速度小于VC大于芦丁，杜仲叶提取物是一个中速抗氧化剂；抗氧化活性与浓度在一定范围内呈良好的量效关系。