舒冠滴丸对动脉粥样硬化兔CD40通路调节作用研究

摘要：目的 观察舒冠滴丸对动脉粥样硬化斑块CD40通路的调节作用。方法 运用高脂高胆固醇饲料造成兔动脉粥样硬化模型，随机分成模型组、舒冠滴丸组、辛伐他汀组，另设空白对照组。采用酶联免疫吸附法测定血浆可溶性CD40L(sCD40L)、可溶性细胞间黏附分子－1(sICAM－1)和血管细胞黏附分子－1(sVCAM－1)浓度。然后，提取AS兔主动脉和心脏进行病理组织形态学观察。结果 舒冠滴丸组血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL－C)水平显著低于模型组(P＜0.01)，舒冠滴丸组血浆sCD40L，sICAM－1水平明显降低，与模型组比较有统计学意义(P＜0.01)，而血浆sVCAM－1水平无统计学意义；病理组织形态学观察，舒冠滴丸组主动脉AS斑块明显少于模型组(P＜0.05)，冠状动脉AS斑块各组差异无统计学意义(P＞0.05)：舒冠滴丸组膜病变较模型组明显减轻，其膜厚度、膜／中膜厚度比、内膜／中膜面积比亦较模型组显著减少(P＜0.01)。结论 舒冠滴丸具有调节血脂紊乱，减少动脉膜斑块数量，消退和稳定AS斑块，降低血浆sCD40L，sICAM－1水平，其作用可能与抑制AS斑块炎症反应有关。

关键词：舒冠滴丸；动脉粥样硬化；细胞间黏附分子－1；细胞黏附分子－1：兔

中图分类号：R543.5 R285.6　文献标识码：A　文章编号：1672－1349(2007)10－0958－03

近年来，越来越多的证据表明炎症在不稳定动脉粥样硬化(AS)斑块的发生、演变及破裂过程中起着至关重要的作用。CD40－CD40L作为重要的炎症信号通路，它的主要生物学效应之一是促进炎症介质如血管黏附分子的释放。细胞间黏附分子－1(ICAM－1)和血管细胞黏附分子－1(VCAM－1)表达增加可促进AS的慢性炎症过程，同时增加AS斑块的不稳定性，加快斑块裂隙，促进斑块破裂、血栓形成。因此，检测外周血可溶性CD40L(sCD40L)、可溶性ICAM－1(sICAM－1)和可溶性VCAM－1(sVCAM－1)浓度可反映AS斑块的炎症程度和稳定性状况。舒冠滴丸是在古方心救汤(《石室秘录》)基础上，结合多年临床经验研制的防治冠心病心绞痛的有效验方，是以冰片、鹅不食草、三七、白芥子、肉桂、公丁香、红参等为主要组成部分，功能芳香通脉、益气温阳、豁痰化瘀。本研究通过构建兔动脉粥样硬化模型，观察舒冠滴丸对AS斑块CD40通路的调节作用，探讨其抗动脉粥样硬化的可能作用机制。

1　材料与方法

1．1　实验动物 清洁级健康日本雄性大耳白兔44只，平均体重2.0 ks(1.9 ks～2.5kg)，由湖南中医药大学实验动物中心提供。医学实验动物合格证：医动字第20～003号。饲养条件：单笼分装，室温(25±2)℃，相对湿度65％±5％，实验前动物在实验饲养房内适应性喂养1周。实验环境设施合格证号：医动字第20-001号。

1．2　实验药物 舒冠滴丸每粒50 mg，由湖南中医药大学附一院药剂科提供，批号：20001030。舒降之片(辛伐他汀，每片20mg)，由默沙东制药有限公司提供，批号：20020530。

1．3　主要试剂、仪器 胆固醇粉(分析纯，每瓶25 g，荷兰进口上海试剂站分装)，猪油(市售)，蛋黄粉(陕西天斗蛋业有限公司提供)；sCD40L试剂盒(奥地利Bender MedSysterns公司提供)sICAM－1，sVCAM－1试剂盒(法国DIACLONE公司提供)，LD－A5型离心机(北京医用离心机厂生产)，CL－7200全自动生化分析仪(日本岛津公司)，721分光光度计(上海第三分析仪器厂制造)，TP－1000电子天平(湘仪天平仪器厂生产)，DG－3022A型酶联免疫检测仪(国营华东电子管制造厂制造)。

1．4　兔动脉粥样硬化模型的建立及分组 将44只实验动物随机分成4组：空白组(8只)、模型组(12只)、舒冠滴丸组(12只)、辛伐他汀组(12只)。以上各组除空白组只给予标准全价营养饲料外，其余各组均每天每只给予高脂饲料100 g(含1.0 g胆固醇、7.5 g蛋黄粉、5.0 g猪油、86.5 g标准全价营养饲料)喂养8周，8周后随机抽取高脂饲料喂养兔2只处死，取胸主动脉标本制作病理切片以证实产生粥样硬化斑块。动脉粥样硬化模型造模成功后，舒冠滴丸组每只每日按人一兔等效量给药[50mg/(kg・d)]，辛伐他汀组每只每日喂服辛伐他汀药液[2.5mg/(kg・d)]，空白组、模型组灌饲蒸馏水10 mL，每组均给药4周，均于上午给食前灌胃。所有动物自由饮水，继续喂养4周。最终取得完整资料者进入分析，共28只，其中舒冠滴丸组7只。辛伐他汀组7只，模型组6只，空白对照组8只。

1．5　指标检测方法

1．5．1　标本处理 各组均于12周后分别从兔颈动脉收集血样(5～6)mL，注入10 mL肝素抗凝离心管，摇匀，3 500 r/min离心3 min，取上清血浆置于－70℃保存待测sCD40L，sICAM－1，sVCAM－1。同时测定血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL－C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL－C)。

1．5．2　血浆sCD40L，sICAM－1，sVCAM－1的检测 采用酶联免疫吸附法测定血浆sCD40L，其检测灵敏度为0.095ng/mL。采用夹心酶联免疫吸附法测定血浆sICAM－1和sVCAM－1，其灵敏度分别为0.1 ng/mL和0.6 ng/mL,批内和批间误差分别在1.03％～2.82％，3.93％～8.15％(sICAM－1)和0.45％～2.27％，0.144％～5.94％(sVCAM－1)。

1．5．3　血脂检测 TC和TG采用酶法测定。即通过特殊氧化酶使底物生成过氧化氢，再通过氧化酶使它们结合成色原(生色团)，产生的颜色与分析物的量成正比，然后用比色法测定生色团的生成量。HDL－C采用磷钨沉淀法，磷钨酸－Mg2+可选择性沉淀LDL和极低密度脂蛋白(VLDL)，上清液则为HDL。即在血清中分别加入MgCl2和磷钨酸液，充分混匀后离心，取上清液进行HDL－C测定。当浓度低于4.5 mmol/L时，VLDL中的胆固醇含量与血中TG浓度成完全线性关系。故可根据已知的HDL－C，TC和TG浓度计算出LDL－C浓度，即根据Friedewald公式[LDL－C(mmol/L)＝TC－HDL－C－TG/2.2]求得。

1．5．4　病理形态学观察 12周末处死动物，取其心脏和主动脉大体标本(从近主动脉弓部到腹腔干分支处)，生理盐水冲洗后沿正中线剪开，铺平，置于10％中性缓冲甲醛液中固定48 h，

常规酒精脱水，石蜡包埋，将其横断面制成4μm厚连续切片，经HE染色，光镜下观察摄像。采用德国远东蔡司公司KS400图像分析系统分别测定斑块面积及内膜总面积，并计算斑块/内膜面积比；从HE染色片上随机选取5个视野，图像分析仪测定内膜及中膜厚度、内膜及中膜面积，并计算内膜/中膜厚度比、内膜/中膜面积比。

1．6 统计学处理 采用SPSS10.0医用统计软件包进行数据资料的统计学处理，多组间比较采用One－way ANOVA检验，用Bonferroni方法进行两两比较，等级资料用秩和检验。

2 结 果

2．1 病理形态学观察结果 血管大体观察结果提示，空白组内膜光滑，未见指纹，无斑块形成；舒冠滴丸组、辛伐他汀组和模型组均可见不同程度脂肪和粥样斑块隆起，模型组尤为明显，斑块连成片状，从主动脉近端到远端，斑块逐渐减轻；舒冠滴丸组、辛伐他汀组斑块明显减少，除近端外，较少连成片状，主要分布于血管分支处。经秩和检验，舒冠滴丸组与模型组比较，主动脉AS斑块明显少于模型组(P＜0.05)；与空白组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。冠状动脉AS斑块各组差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表1。

2．2 各组血浆sCD40L及血管黏附分子水平的变化 舒冠滴丸组、辛伐他汀组血浆sCD40L，slCAM－1水平明显降低，与模型组比较有统计学意义(P＜0.01)；辛伐他汀组血浆sVCAM－1水平降低与模型组比较有统计学意义(P＜0.05)。舒冠滴丸组、辛伐他汀组两组间无统计学意义。详见表2。

2．3 各组血脂水平变化情况 舒冠滴丸组、辛伐他汀组、模型组各项血脂水平高于正常范围，且血清TC，TG，LDL－C水平显著高于空白组(P＜0.01)。而舒冠滴丸组、辛伐他汀组血清TC，TG，LDL－C水平显著低于模型组(P＜0.01)，HDL－C水平则无统计学意义(P＞0.05)。舒冠滴丸组、辛伐他汀组两组间无统计学意义。详见表3。

2．4 病理细胞学观察结果 HE染色可见，空白组主动脉内皮细胞排列完整，中膜外膜分界清楚，无泡沫细胞堆积及斑块形成；冠状动脉血管内皮完整、光滑，内膜不增厚，管腔无狭窄。模型组主动脉内膜显著增厚，内皮不光滑不完整，斑块隆起明显，内含大量泡沫细胞；冠状动脉内膜增厚，斑块形成，管腔狭窄3/4。舒冠滴丸组和辛伐他汀组内膜可见部分增厚，内皮细胞排列较完整，其下有少量泡沫细胞堆积，有少许斑块隆起，冠状动脉血管腔狭窄1/2。舒冠滴丸组、辛伐他汀组斑块/内膜面积比、内膜厚度、内膜／中膜厚度比、内膜／中膜面积比模型组显著减少(P＜0.01)，而舒冠滴丸组、辛伐他汀组两组间无统计学意义(P＞0.05)。详见表4。

3 讨 论

冠心病发生的主要病理基础是AS的形成。在AS斑块形成过程中，血管内皮的破损和内皮功能的减退，内皮通透性增加，血脂含量增加，炎性细胞浸润，平滑肌细胞增殖、迁移和脂质氧化、变性以及血小板激活、细胞坏死、基质合成等发挥重要作用。

CD40L属于肿瘤坏死因子超基因家族中的一员，CD40L以细胞膜结合或血液中游离状态两种形式存在，并与CD40结合产生一系列的炎性反应，包括促进黏附分子如血管黏附分子等物质的产生。近来的研究还提示，CD40L可通过调节粥样斑块的金属蛋白酶表达，从而影响斑块的稳定性。sICAM－1和sVCAM－1属免疫球蛋白超家族分子，sICAM－1主要在内皮细胞表达，通过白细胞上的配体CD11/CD18复合物特异性结合，介导单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞与血管内皮细胞黏附。最近的研究发现激活血小板上的CD40L可上调血管内皮细胞的sVCAM－1、sICAM－1和E－选择素的表达。Kotowicz等也发现，CD40L能显著增加人体脐静脉血管内皮细胞sICAM－1和sVCAM－1的表达。血管性黏附分子表达的增加将进一步促进炎症细胞黏附于血管内皮，加速动脉粥样硬化斑块的不稳定性，损害斑块表层纤维帽结构，促进斑块破裂、血栓形成，从而导致急性冠脉综合征的发生。

本研究通过构建兔动脉粥样硬化模型，观察舒冠滴丸对AS兔CD40通路的调节作用，结果表明舒冠滴丸能显著降低TC，TG，LDL水平，升高HDL，具有调节脂质代谢紊乱，减少动脉内膜斑块数量，延缓AS的进程，促进AS病变消退作用，降低血浆sCINOL，sICAM－1水平，抑制斑块内的炎症反应，延缓AS的进展，促进斑块的稳定，可为临床合理运用提供新的理论和实验依据。