脂康对高脂血症家兔血脂及肝脏LDL-RmRNA影响的研究

摘要：目的 通过建立新西兰家兔高脂血症模型，探讨肝脏低密度脂蛋白受体(LDL－R)基因水平与高脂血症形成的关系。方法 建立高脂血症家兔模型；观察肝脏的病理改变；应用原位杂交方法检测肝脏低密度脂蛋白受体基因水平。结果 脂康可有效降低血脂水平，井能有效上调肝脏低密度脂蛋白受体基因水平。结论 脂康可激活肝脏细胞膜LDL－R基因表达，使LDL－R的活性增强，有效调节血脂水平，从而延缓改善动脉粥样硬化的形成。

关键词：高脂血症；低密度脂蛋白受体；基因表达

中图分类号：R285.5　文献标识码：A　文章编号：1672－1349(2007)10－0963－03

脂康由黄芪、沙棘、山楂、红花、丹参、三七粉等组成，具有健脾益气、祛痰降浊、活血化瘀之功效，适用于高脂血症及轻中型冠心病，在临床上取得了一定疗效。脂康通过健脾益气，调整阴阳气血和脏腑功能，减少浊脂产生，清除人体内的痰浊、瘀血等有害物质，减少外源性脂质的吸收，抑制脂质合成，促进脂质的转运和清除，影响脂质的肝肠循环，加速脂质排泄等多种途径调节血脂。本实验主要从基因水平研究脂康对高脂血症家兔肝脏低密度脂蛋白受体基因表达的调节作用，从而探讨脂康调节血脂的主要机制。

1　材料与方法

1．1　脂康方药的制备 本处方由沙棘、山楂、丹参、红花、黄芪、三七等为主组成。经醇提、水提、干燥后制成丸剂，每丸0.5 g，每克含6 g生药。

1．2　实验动物造模及用药方法 纯种新西兰大耳白兔60只，体重(1.9～2.1)kg，兔龄4个月，随机选取10只为正常组，喂饲普通颗粒饲料，150 g/d，其余50只给予高脂饲料(1％胆固醇、5％蛋黄粉、5％猪油、89％普通饲料)喂饲，150 g/d。于第4周末根据胆固醇情况随机分为5组，每组10只，模型对照组给予高脂饲料喂饲，150 g/d；其余用药组除给予高脂饲料喂饲150g/d外，脂康低剂量组给予脂康浸膏0.2 g/(kg・d)；脂康高剂量组给予脂康浸膏0.4 g/(kg・d)；血脂康对照组给予血脂康0.18/(ks・d)；辛伐他汀对照组给予辛伐他汀0.8 mg/(kg・d)。家兔用药剂量按人和动物体表面积换算，脂康低剂量或脂康高剂量相当于人60 kR每日的药量。

喂饲8周后，麻醉，心脏取血，用于血脂项目检测。取靠近肝门静脉处的肝脏组织，直径约2 cm，用浓度10％甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，用光镜观察。另取肝脏组织，直径约1cm，用浓度4％多聚甲醛固定后做LDL－RmRNA(原位杂交)检测。

1．3　生化指标检测 分别于用药前取耳缘静脉血及用药后心脏取血10 mL，离心3000 r/min，10 min，取血清分装，－20℃冰箱保存，血清总胆固醇(TC)和三酰甘油(TG)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL－C)含量测定采用酶法，根据Friedward公式法计算低密度脂蛋白胆固醇(LDL－C)，即LDL－C＝TC－(TC/2.2＋HDL－C)。动脉硬化指数(AlP)为TG与HDL－C摩尔浓度比值的对数。血脂检测检测试剂盒：北京中生生物工程高技术公司生产的试剂盒；LDLR ISH原位杂交试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司提供。

1．4　肝脏组织LDL－R mRNA原位杂交检测

1．4．1　实验步骤　将新鲜的肝组织切成不超过4 mm的小块，并及时用固定液固定1 h。常规脱水、浸蜡、包埋，切片厚度为(6～8)μm。石蜡切片经常规二甲苯、乙醇脱蜡，滴加H2O2室温(5～10)min以灭活内源性酶。暴露mRNA核酸片段：切片上加3％枸橼酸新鲜稀释的胃蛋白酶。37℃，(12～15)min，清洗。固定，胃蛋白酶消化后在玻片上滴加固定液室温固定10 min，清洗3次。预杂交，首先将湿盒准备好，每张切片滴加20 μL预杂交液，放人湿盒内，(38～42)℃4 h，甩去多余的液体。杂交：在每张玻片上滴加20μL杂交液，将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。放恒温箱杂交过夜。杂交后洗涤。滴加封闭液：放入37℃30 min后取出，甩去多余液体，不洗。滴加生物素化鼠抗地高辛，放入37℃60 min，PBS洗涤。滴加SABC；放入37℃30 min，PBS洗涤。滴加生物素化过氧化物酶，37℃恒温箱中放置30min，PBS洗涤。DAB显色，使用DAB显色试剂盒，滴至玻片上，显色(30～50)min，充分水洗，苏木精复染，充分水洗，酒精脱水，二甲苯透明，封固。

1．4．2　原位杂交实验结果判定 光学显微镜下观察结果的判定标准：原位杂交结果以细胞浆内或核膜上出现棕黄色颗粒者或斑片为阳性细胞。

1．4．3　分析方法 计算机图像分析，在图像卡IBM586和OlympusBX60显微镜组成的图像处理系统上，测定阳性细胞数：每组每只大鼠各5个高倍视野(10×40)下原位杂交阳性细胞率(％)。

1．5　统计学处理 计量资料采用单因素方差分析(F检验)，结果用均数±标准差(x±s)表示。用SPSS 10.0统计软件对结果进行统计。

2　结 果

2．1　血脂水平变化 本实验结果提示脂康高剂量组对高脂血症家兔血清TC，TG，LDL－C水平有显著的降低作用(P＜0.01)，对HDL－C有显著升高作用(P＜0.01)。脂康高剂量与西药辛伐他汀对照组比较，在降低家兔血清TC，TG，LDL－C的作用相近，升高HDL－C作用优于辛伐他汀；与中药血脂康比较，在降低家兔血清TC、LDL－C的作用明显优于血脂康，降低7G水平作用相近，升高HDL－C水平作用优于血脂康。

2．2　肝脏病理学变化 正常对照组：肝细胞内无大脂滴，只可见少量细小脂滴，无炎性细胞浸润。模型对照组：弥漫性肝细胞脂肪变性，可见炎细胞浸润，高倍镜下可见细胞质内吞噬大量脂质，呈空泡状，核仁消失，大部分呈脂肪变性的肝细胞膜消失，相互融合，胞质疏松呈网状。有的核仁被融合脂滴挤到一边。有大量炎性细胞浸润。各治疗组：高倍镜下可见脂滴，肝细胞呈空泡变性，无核肝细胞增多，病变程度比模型组轻。有少量炎性细胞浸润。脂康低剂量组肝细胞脂肪变性较其余组明显，脂康高剂量组病变程度最轻，可见到正常的肝细胞，有少量炎性细胞浸润。

2．3　肝脏LDL－R mRNA水平变化 肝脏LDL－RmRNA的阳性表达信号可见细胞浆内出现棕黄色颗粒，应用图像分析系统计算各组的阳性表达率，正常对照组与模型对照组、脂康高剂量组及辛伐他汀对照组比较有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，模型对照组明显低于其他各组(P＜0.01)，脂康高剂量组明显高于其余各组。详见表1。

3　讨 论

本研究利用核酸原位杂交法观察脂康对高脂血症兔肝细胞LDL－R基因表达的影响。研究结果表明，模型对照组高胆固醇兔肝细胞LDL－R mRNA表达水平与正常对照组相比明显降低，而给高胆固醇兔脂康和相关药物后，其肝细胞的LDL－RmRNA表达水平又明显提高，尤其是脂康高剂量组最为明显。可见，脂康有显著激发、上调高血脂兔肝脏细胞LDL－R基因表达的效应，提高了LDL－R基因表达强度，这就是脂康从分子水平上调节脂质代谢作用的有力证据。

研究表明，饮食中的胆固醇可以使肝脏LDL－R mRNA水平降低，因此降低了肝脏LDL－R数量，引起血循环中LDL的堆积。脂康提高LDL－R基因表达的可能机制是脂康通过理脾，增强了脾的主动运化功能，而脾的正常运化、升清降浊又促进了肝的正常疏泄。动脉粥样硬化的病理基础主要是肝脾失调，而痰瘀是其病变之标，因此在治疗时以调脾为主同时注意调肝、疏肝，从整体上改善了机体代谢环境，加强了机体代谢机能，显著降低了血清TC，LDL－C水平。LDL－R基因启动子5，区域存在着一个顺式作用调节元件――胆固醇调节单位I(sterol regulatory element I，SRE－I)，SRE－I作为一个条件性增强子，当细胞胆固醇降低时可促进LDL－R基因表达，解除了对LDL－R基因表达的抑制作用，从而为激活肝脏细胞膜LDL－R基因表达创造了条件。从实验结果看，治疗组肝脏细胞的LDL－R基因表达强度显著高于正常组，可能是在LDL－R基因表达的抑制解除后，LDL－R的活性大大增强，清除了LDL－C，又不断促进LDL－R基因表达，加速了脂蛋白的分解。由于LDL－R的这种降解作用，使血中LDL－C更趋减少，从而使脂蛋白的代谢进入了良性循环。由于基因水平这一调控机制的存在，使细胞能够保持胆固醇的精巧平衡。

本方对LDL－R基因表达有显著的上调作用，这种作用是否对LDI－R具有翻译和翻译后水平的调节作用，从而达到调控血脂水平的目的，还有待进一步研究。