异种生物衍生骨与兔骨髓间充质干细胞的体外黏附实验研究

【摘要】 目的：探寻良好的骨组织工程支架材料。方法：以市售新鲜猪股骨制备一种生物骨衍生材料，将材料与兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合培养，扫描电镜下对复合培养过程进行动态观察。结果：异种生物衍生骨具有三维立体多孔结构，并有良好的生物相容性和材料细胞界面。结论：异种生物衍生骨是一种具有临床应用前景、适用于构建组织工程骨的支架材料。

【关键词】 骨支架材料； 生物衍生骨； 骨髓间充质干细胞

Experimental Study of Rabbit Bone Mesenchymal Stem Cells With Xenogeneic Biological Derivative Cancellous Bone/XIAO Shi-hui，WEI Qing-jun，WEI Ji-hua，et al.//Medical Innovation of China，2012，9(13)：003-005

【Abstract】 Objective：To explore good bone tissue engineered scaffold.Methods：To made biological derivative bone material with fresh pig femoral，then coculture with rabbit bone mesenchymal stem cells，the cell attachment and growth were detected to evaluate the celluar compatibility to biomaterial.Results：Xenogeneic biological derivative cancellous bone have 3D porous structure，meanwhile have good biocompatibility and material-cell interface.Conclusion：There are bright prospects in clinic application for the xenogeneic biological derivative cancellous bone，applicable to the construction of the bone tissue engineering.

【Key words】 Bone scaffold material; Biological derived bone; Bone mesenchymal stem cells

First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China

doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2012.14.002

创伤、肿瘤术后等原因常常造成大段骨缺损、肢体功能丧失。为了满足修复治疗的需要，众多研究者摸索了大量修复骨缺损的方法，目前组织工程提供了一个新的途径，运用组织工程的方法，以支架材料为载体，复合分离的种子细胞，在体外预先构建有生命的种植体，植入体内以修复组织缺损，替代后重建器官结构，维持改善组织器官功能。本实验从探寻良好的骨组织工程支架材料的目的出发，拟制备一种生物骨衍生材料，将此材料与兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外复合培养，通过电镜对复合培养过程进行动态观察，了解该材料与BMSCs的生物相容性及黏附情况，寻找一种有临床应用前景，适用于构建组织工程骨的支架材料。

1 材料与方法

1.1 实验动物 纯种新西兰大白兔1只，4周龄，体重1.5 kg，购自广西医科大学实验动物中心。

1.2 主要仪器 培养箱(HERACAN 150i)，超净工作台(苏净)，倒置显微镜(OLympus CKX41)，离心机(上海飞鸽)，VEGA3 TESCAN扫描电镜(捷克)，低糖DMEM培养基(Hyclone)，胎牛血清(杭州四季青公司)，0.25%胰蛋白酶(吉诺)。

1.3 实验方法

1.3.1 生物衍生骨的制备 取新鲜市售新鲜猪股骨，剔除周围软组织、骨膜和关节软骨，保留松质骨，再将其制成1 cm×0.4 cm×0.3 cm的骨条，经脱蛋白、脱脂、脱钙后制成生物衍生骨，-80 ℃深低温冰箱保存48 h后，经环氧乙烷消毒，-4 ℃保存备用。取部分骨支架做扫描电镜观察支架形态[1]。

1.3.2 兔BMSCs的分离 3%戊巴比妥钠按1 ml/kg剂量经兔耳缘静脉行全身麻醉。常规消毒铺巾，于双侧股骨近端及胫骨近端作骨穿(注射器内含0.2 ml的肝素钠200 U/ml)，抽取骨髓4~5 ml，抽出的骨髓血立即用等量的PBS洗涤后，离心1000 r/min，离心5 min，弃去上清液，重复上述操作2次后，接种于50 ml的培养瓶，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，3 d后全量换液，去除悬浮细胞。原代培养细胞长满瓶底面积80%~90%时，加入0.25%胰蛋白酶消化2~3 min，加含血清的DMEM培养基终止消化。1000 r/min离心5 min，弃上清液，以1∶3接种。

1.3.3 细胞与支架的复合 无菌条件下取第3代骨髓间充质干细胞(BMSCs)，以胰蛋白酶消化细胞后吹打制成单细胞悬液，调整细胞数量约为2×106/ml，用微量移液枪将细胞悬液250 μl滴入预湿处理过的生物骨衍生材料松质骨面上，使之充分渗入。预培养4 h后，小心加入含10%胎牛血清的L-DMEM培养基中复合培养，隔日换液，倒置显微镜及电镜观察复合培养的情况，了解材料与BMSCs的相容性及黏附情况。

1.3.4 细胞在材料上的增殖检测 取处理后的异种骨支架24块，以上述方法接种细胞。24 h后取复合物3块用PBS冲洗材料，使未贴壁的细胞脱落，再用0.25%胰酶消化，计算附着于材料上的细胞数。以后每天取3块材料按同样的方法计数细胞连续计数8 d。

2 结果

2.1 异种生物衍生骨外观呈乳白色，具有天然网架孔隙结构。扫描电镜下观察孔隙不规则，生物衍生骨支架表面粗糙，可见大小不等的裂隙与微孔，并互通形成网状结构。孔隙直径：150.8~306.7 μm，平均直径：225.3 μm。孔隙率：84.5%~89.7%。见图1、图2。

图1 支架外观 图2 扫描电镜下支架外观(×100)

2.2 倒置显微镜观察原代培养的兔BMSCs呈成纤维细胞样生长，细胞成梭形或多角形，细胞轮廓清晰，细胞质折光性好，但存在一部分杂细胞，通过多次换液后，传代培养的BMSCs杂细胞数量明显减少，逐渐形成细胞集落，并绕集落呈放射样排列，表现出骨髓间充质干细胞的生长特点且生长力旺盛。见图3、图4。

图3 原代培养的兔BMSCs(×100) 图4 传代培养的兔BMSCs(×100)

2.3 扫描电镜(SEM)下观察到复合培养的情况：复合培养3 d发现细胞附着与材料表面，细胞形态不均一，有的成梭形，有的细胞扁平状平铺于支架孔隙侧壁有多个突起，见图5。培养5 d后，细胞生长连接成片呈层状生长，细胞接触紧密，见图6。7 d后细胞多层生长，细胞生长成堆，部分区域有细胞外基质分泌，见图7。

2.4 细胞在支架材料的增殖能力 从描绘出来的增殖曲线可以看出，细胞在异种骨支架上的增殖情况与细胞在培养瓶中培养时的生长情况相似。从曲线的变化可以看出，细胞与支架复合培养后，rBMSCs在接种的前2 d为细胞潜伏适应期，第3~6天生长曲线基本为线性曲线，表明这段时间是细胞的对数生长期。第6天后曲线逐渐变得平缓，细胞增殖减慢，表明细胞增殖进入平台期。见图8。

3 讨论

在组织工程中，细胞与材料的复合是一项较为复杂的技术，细胞与材料的相互作用也是极为重要的，在构建组织工程骨的过程中，细胞与材料的粘附是基础，只有种子细胞与材料发生适当地粘附，才能进一步发生增殖和分化。然而，细胞与材料的粘附作用受到材料的含水量、材料表面理化性质、材料表面的改性处理、材料表面几何性质、表面特化结构等因素的影响[2]。所以在实验过程中应该选择适当的细胞外基质作为组织工程骨支架材料。理想的支架材料必须要有具备如下特点[3]：(1)具有良好的三维立体多孔结构；(2)吸收动力学与新的骨组织形成速率匹配，使局部负荷逐渐过渡到新生骨组织；(3)材料降解产物应无毒且容易被机体排出，具有良好骨传导及骨诱导作用，生物相容性好；(4)与宿主骨有相似的机械性能，能与之间形成稳定的界面，局部不易诱发形成瘢痕组织；(5)可以耐受国际标准要求的对于用于临床的骨支架的灭菌方法；(6)能够制备与缺损组织形态相似的最佳的支架形态。

生物衍生骨支架材料主要指异体骨和异种骨材料，通过各种理化方法可以降低甚至基本消除其抗原性，因此，异种骨研发应用的前景更为广阔。处理过后天然生物衍生骨材料保留原有骨的骨小梁、小梁间隙及骨盐支架的三维结构，解决了其他骨支架材料的孔隙率、孔隙直径大小、孔隙连通等方面的问题，因此，天然衍生骨材料具有良好的细胞材料界面。同时由于骨组织结构的高度同源性，呈现良好的生物相容性。雷荣昌等[4]用兔骨髓基质干细胞成骨诱导后与猪松质骨支架体外复合培养，通过扫描电镜观察猪松骨材料对成骨细胞生长、粘附的影响，发现松质骨支架联合培养1 d后，可见细胞附着于材料表面，但数量不多，细胞呈圆球形，7 d后细胞生长密集，似葡萄状粘附于脱矿猪松质骨的孔壁上，细胞呈不规则圆球形，细胞相互融合，可见细胞遮盖微孔间隙。党洪胜等[5]利用胎兔成骨细胞与经肝细胞生长因子(HGF)修饰的异种脱蛋白松质骨(DPB)进行体外复合，电镜发现成骨细胞能够在DPB表面附着及生长，且HGF/DPB对成骨细胞的碱性磷酸酶活性有明显的促进作用，并能促进成骨细胞的增殖。马绍英等[6]将兔骨膜源性成骨细胞与冻干人松质骨支架复合培养，电镜观察发现体外复合培养3 d，细胞粘附伸展，个别部位有少量细胞增殖；培养1周，形成了由一层或几层细胞构成的细胞膜片，覆盖整个骨小梁网架表面；培养3周，所形成的细胞膜片已较厚，细胞表面有基质分泌。四川大学华西医院对异种骨的改进做了一系列的研究，制成部分脱钙骨(PDCB)、部分脱蛋白骨(PDPB)、复合型完全脱蛋白骨(CFDB)三种材料，三种材料都保持原骨组织的天然网状孔隙结构，都有良好的生物相容性，分别与人胚骨膜成骨细胞体外复合培养，结果显示三者都有良好的成骨性[7]。

本实验采用异种骨通过脱蛋白、脱脂、脱钙，深低温冷冻制成生物骨衍生材料，将其与培养、扩增后的兔BMSCs共同培养，实验结果：电镜下观察支架具有三维孔隙结，BMSCs不仅能与生物骨衍生材料黏附，而且能在支架上分裂、增殖，表明此种方法制备的异种生物衍生骨材料与骨髓间充质干细胞在体外有较好的生物相容性和细胞材料界面，且具有骨诱导特性，是一种有临床应用前景的、适用于构建组织工程骨的支架材料。

参考文献

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[2] 裴国献，魏宽海，金丹.组织工程学实验技术[M].北京：人民军医出版社，2006：199-200.

[3] Porter J R，Ruckh T T，Popat K C.Bone tissue engineering： a review in bone biomimetics and drug delivery strategies[J].Biotechnology Progress，2009，25(6)：1539-1560.

[4] 雷荣昌，翦新春.松质骨支架与成骨细胞生物相容性的实验研究[J].口腔实验研究，2005，21(5)：531-533.

[5] 党洪胜，赵猛，严永祥，等.胎兔成骨细胞与复合肝细胞生长因子/异种脱蛋白松质骨的体外培养[J].中南大学学报(医学版)，2008，33(4)：359-364.

[6] 马绍英，李宝兴，赵亚平，等.骨膜成骨细胞与生物衍生骨材料联合培养的实验研究[J].西部医学，2008，20(1)：16-19.

[7] 杨志明，李彦林，解慧琪，等.生物衍生骨支架材料的组织相容性研究[J].中华整形外科杂志，2002，18(1)：6-8.

(收稿日期：2012-03-01) (收稿日期：李静)