绿茶多酚对表皮HaCaT细胞光损伤的干预作用研究

[摘要]目的：本文旨在观察没食子儿茶素没食子酸酯 （EGCG）对中波紫外线（UVB）引起的表皮HaCaT细胞损伤，以及对细胞着色性干皮病蛋白A（XPA）和切除修复互补交叉蛋白1（ERCC1）蛋白表达的影响。方法：以30mJ/cm2 UVB照射HaCaT细胞，照光前后加入50g/mL EGCG进行干预，Western blot法检测细胞XPA和ERCC1蛋白的表达水平。结果：UVB照射后细胞内XPA和ERCC1蛋白表达水平逐渐增高，在照光后4h达到峰值，后逐渐恢复至接近正常值；加入EGCG干预可明显降低XPA和ERCC1蛋白的表达水平。结论：EGCG对紫外线光损伤的干预作用可能与调控细胞内XPA和ERCC1蛋白的表达有关。

[关键词]UVB；HaCaT细胞；XPA；ERCC1；EGCG

[中图分类号]R75 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）17-1401-03

Effects of EGCG on UVB induced the photodamage in HaCaT cells

LIN Xiang-fei1，MIN Wei2，ZHU Xiao-fang1，LUO Dan3

（1.Department of Dermatology，Clinic Medical College of Yangzhou University，Yangzhou 225001，Jiangsu，China；2.Department of Dermatology，The First Affiliated Hospital of Soochow University；3.Department of Dermatology， The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University）

Abstract： Objective To investigate the effects of EGCG on photodamage induced by UVB irradiation XPA and ERCC1 proteins expression in HaCaT cells. Methods HaCaT cells were irradiated with 30mJ/cm2 UVB.50 g/mL EGCG was added into the medium before or after UVB irradiation. Western blot assay was used to measure XPA and ERCC1 expression. Results 30mJ/cm2 UVB irriadiation increased the XPA and ERCC1expression which arrived at the peak at 4h after UVB irradiation.EGCG treatment significantly inhibited the XPA and ERCC1expression. Conclusion The effects of EGCG on UVB induced the photodamage in HaCaT cells maight be related with the inhibitory efficency of EGCG on XPA and ERCC1 expression.

Key words：UVB；HaCaT cell；XPA；ERCC1；EGCG

日光中的中波紫外线（UVB）是导致皮肤光损伤，如日晒伤及皮肤肿瘤发生的最重要的环境因素。UVB可引起表皮细胞DNA损伤和光产物形成，包括环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）和6-4光产物（（6-4）PPs）[1-2]。皮肤细胞可通过核苷酸切除修复（NER）机制等对上述DNA损伤进行修复，目前已知30多种基因参与NER过程[3-4]。大量研究证实绿茶多酚具有广泛的生物学效应，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤等[5]。我们的前期实验表明绿茶多酚主要活性成分EGCG对紫外线引起的皮肤细胞光损伤具有显著抑制作用[6-8]。本研究将观察EGCG对表皮HaCaT细胞中DNA损伤修复相关基因产物XPA和ERCC1蛋白表达的影响，从而探讨EGCG的光保护作用机制。

1 材料和方法

1.1主要试剂： RPMI 1640培养基（Gibco公司，美国）；小牛血清（杭州四季清生物公司）；EGCG（Sigma公司，美国）；GAPDH、XPA和 ERCC1单克隆抗体（Abcam公司，美国）；PVDF膜（Millipore公司，美国）；ECL（Cell Signaling公司，美国）。

1.2细胞培养：在37 C、5% CO2条件下用含10%小牛血清的1640培养基培养表皮永生化角质形成细胞系HaCaT 细胞。当培养的细胞生长至80%融合时，以0.25%胰酶消化并调整细胞浓度为1×106/ mL，接种到培养皿中继续培养。

1.3 UVB照射：以SUV-100日光紫外线模拟器（上海SIGMA技术有限公司）对HaCaT细胞进行照射，UVB剂量=UVB辐射度×时间（s），照射剂量为30mJ/cm2。

1.4EGCG干预处理：将HaCaT细胞等量接种于3.5cm培养皿中，于照光后0、1、2、4、8、12和24h收集细胞总蛋白。EGCG处理组分为照光前加药干预及照光后加药组，药物孵育浓度为50 g/mL，于照光后4h收集细胞总蛋白。实验重复3次。

1.5 Western blot检测：分离提取细胞总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度。制备10%SDS-PAGE胶，加样体积为20μl，40mA恒流电泳2h，100V恒压电泳1h，PBST液洗涤PVDF膜5min/1次，加入一抗，37℃孵育2h；PBST液振荡洗涤2次，加入二抗（1：200稀释），37℃孵育20min；ECL显色显影，凝胶成像系统扫描分析。

1.6统计学分析：所有数据采用SPSS 11.0统计分析软件进行处理，以均数±标准差（x±s）表示，组间采用t检验，P

2 结果

2.1UVB对XPA和ERCC1蛋白表达水平的影响：以30mJ/cm2UVB 照射HaCaT细胞，照光后0、1、2、4、8、12和24h收集细胞总蛋白，检测XPA和ERCC1蛋白表达水平。与对照组相比，UVB照射后细胞内XPA和ERCC1蛋白表达水平均明显升高，在照光后4h达到最高值，随后蛋白表达水平逐渐恢复至接近正常水平，但仍高于对照组（如图1），与对照组相比，XPA和ERCC1蛋白表达水平增高差异有统计学意义（P

2.2 EGCG对UVB引起的HaCaT细胞XPA和ERCC1蛋白表达水平的影响：将细胞分为对照组、EGCG非照光组、照光前加药处理组、照光后加药处理组及UVB组。于照光后4h收集蛋白， Western blotting检测XPA和ERCC1蛋白表达水平。结果表明，与对照组相比， 单纯EGCG处理对XPA和ERCC1蛋白表达水平没有显著影响；30mJ/cm2UVB照射可明显升高细胞内XPA和ERCC1蛋白表达水平，而在照光前或照光后加入EGCG干预均可显著降低XPA和ERCC1蛋白表达水平，差异有统计学意义（P

3 讨论

人类皮肤是抵抗紫外线损伤的首要防线，其中表皮角质形成细胞是 UVB作用的重要靶细胞。UVB辐射引起的表皮细胞DNA损伤和光产物产生主要通过NER过程进行修复，NER机制包括转录伴随修复（TCR）和全基因组修复（GGR）两种途径，其主要步骤有：①识别损伤；②损伤DNA双链解螺旋；③切除损伤部位；④移除包含损伤的DNA延伸链；⑤DNA再合成及连接。研究已证实NER过程中有包括XPA、ERCC1、增殖细胞核抗原（PCNA）、p53等30多种基因产物参与其中。XPA特异性识别紫外线或化学性导致的DNA损伤，并且启动NER起始损伤识别步骤，稳定在DNA损伤位置装配的多蛋白修复复合体[9]。ERCC1对于损伤DNA的NER修复是必需基因[10]。EGCG是绿茶多酚中最主要和最有效的成分，并有抗突变、抗氧化、抗肿瘤形成、抗炎及调节免疫功能等多种生物学效应。我们在前期研究中业已证实EGCG对人皮肤细胞，包括角质形成细胞和成纤维细胞具有显著的光保护效能。

本研究主要观察了UVB和EGCG干预对细胞NER修复途径中的关键调控蛋白XPA和ERCC1表达的影响，籍此阐明皮肤细胞紫外线光损伤和EGCG光保护作用的分子机制。Western blotting检测结果表明，和非照光组相比，30mJ/cm2UVB照射后，HaCaT细胞中XPA和ERCC1蛋白表达水平均逐渐升高，照光4h后逐渐恢复下降，这表明皮肤细胞经受UVB损伤后，其DNA修复过程发生在照光后立即开始，在4h左右达到高峰并逐渐停止，如DNA损伤未能及时修复，将导致基因突变，甚至皮肤恶心肿瘤的发生。而单纯加入EGCG与干预时，细胞XPA和ERCC1蛋白表达无明显变化，这表明EGCG对皮肤细胞无损伤刺激作用。而在UVB照光前或照光后加入EGCG分别进行干预时，细胞内UVB诱发的XPA和ERCC1蛋白表达水平增高情况均被明显抑制。这些结果提示EGCG在照光前后进行干预均能显著抑制UVB辐射引起的细胞DNA损伤，从而表现为较弱的NER修复反应过程。

总之， EGCG可在一定程度上抑制UVB诱发的皮肤细胞XPA和ERCC1蛋白表达，表明EGCG的光保护作用可能与调控上述蛋白表达有关。

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[收稿日期]2014-06-10 [修回日期]2014-07-31