变性梯度凝胶电泳技术在微生物实验教学中的应用

摘要：自然界大部分微生物是未培养微生物，变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种不依赖微生物培养的技术，本文介绍了其原理、流程和在微生物研究性实验教学中的应用，通过开设DGGE在微生物群落结构分析中的应用等研究性实验项目，不仅增加了学生对微生物多样性和群落结构变化的认识，而且有效地激发了其学习兴趣，促进了学生分析问题、解决问题能力的培养和提高。

关键词：变性梯度凝胶电泳；微生物实验；实验教学改革

中图分类号：G462 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2013）39-0247-02

微生物学是高等院校生物类专业的一门重要专业基础课，是一门实验性和应用性很强的学科。微生物学实验是微生物学的重要组成部分，是现代生物学技术的重要基础，对于学生加深理论知识的理解，培养创新与实践能力具有非常重要的作用[1]。传统的微生物实验教学内容一般以验证性和演示性为主，注重培养学生的基本实验技能，但对学生综合实验技能和创新能力的培养有待提高。随着国家对创新人才的需求，适当增加综合性和研究性实验内容的比重是微生物实验教学改革的发展方向，对于提高学生的思维能力、动手能力有着积极的作用[1-3]。

本校非常重视实验教学改革工作，鼓励学生在掌握基本实验技能后，积极参加设计性、研究性实验，包括院校两级的大学生科研立项或教师的研究课题，并给予相应的创新学分。通过该项措施进一步激发了学生的学习兴趣，并有效提高了学生的实验技能及分析问题和解决问题的能力。目前微生物实验教学主要包括传统的微生物实验技术，随着分子生物技术的发展，微生物研究技术突破了以往主要依赖纯培养物的局限性，特别是在生态环境样品中的微生物群落结构分析中，基于PCR扩增的分子生物学方法逐渐取代了传统的培养方法，大大拓展了微生物研究的范围[4]。因此，我们在后续的研究性实验中引入了变性梯度凝胶电泳在微生物群落结构分析中的应用等创新型实验项目，使实验教学从基础性向综合性和研究性推进。

一、变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术概述

由于自然环境中微生物生存条件的复杂性，大多数微生物以未可培养的形式存在。DGGE是一种不依赖微生物培养技术的研究方法，能快速、准确鉴定环境中微生物种群，在揭示复杂微生物群落演替规律和功能基因多样性方面具有独特的优越性，已被广泛应用于微生物分子生态学研究各领域[5]。DGGE技术的基本原理是在聚丙烯酰胺凝胶的基础上，加入呈梯度分布的变性剂（甲酰胺及尿素），双链DNA分子部分解链导致电泳迁移率降低，而序列不同的DNA分子解链行为不同，在凝胶中的移动速度也就不同，从而使得长度相同而序列不同的DN段分离。因此，通过测序分析凝胶上不同的谱带，可以检测微生物种群的遗传多样性和动态变化[6]。DGGE技术的工作流程主要包括以下几个步骤：（1）环境样品的采集；（2）样品中微生物基因组DNA的提取；（3）DN段的PCR扩增；（4）PCR产物的DGGE分析；（5）DNA条带的序列分析。

二、变性梯度凝胶电泳技术在微生物实验教学中的应用

变性梯度凝胶电泳技术是一项综合性较强的实验技术，涉及的知识面较广，要求学生既要有全面扎实的理论知识，又要求较强的实际动手能力。我校的微生物学实验安排在大学二年级的上学期，通过学习使学生掌握微生物学实验的基本原理和操作技术。此外通过后续的生化分析技术和分子生物学实验等课程，学生掌握了聚丙烯酰胺凝胶电泳、基因组提取和PCR扩增等实验技术。因此该项研究性实验项目主要面向大学二年级和三年级的学生，我们为学生提供开放的实验室环境，学生自己组成实验小组，可根据自己的实际情况安排时间。整个实验由学生实验小组开展并完成，同时在实施过程中配备指导教师进行随时指导。根据学生的学习兴趣并结合实验室的科研课题，我们近几年开设了多项DGGE技术在微生物研究中应用的实验，包括《氯嘧磺隆对土壤微生物类群的影响》、《SBR反应器中聚磷菌群的结构分析》、《不同森林土壤中产漆酶细菌群落结构的研究》和《厌氧污泥对偶氮废水的脱色及污泥菌群结构分析》等研究性实验项目。环境样品中DNA的提取是影响微生物多样性的DGGE检测结果的重要因素[7]，学生通过比较不同提取方法对DNA产量和纯度的影响，确定了针对不同的实验样品（土壤或污泥）的最佳提取方法，在这一过程中加深了对DNA提取原理和方法的认识。通过DGGE图谱的分析，学生可以直观地了解到污染胁迫等环境条件下微生物群落结构的改变及优势菌群形成的动态过程，更加深刻地理解富集培养技术在分离特定功能微生物上的应用。学生通过后续的序列比对分析，可以学习到相关环境中常见的微生物优势菌属，特别是一些非培养微生物序列的出现丰富了学生对微生物多样性的认识。通常面向本科生开设的微生物实验主要以好氧微生物为对象，因此学生接受的微生物学知识侧重于好氧微生物，对厌氧微生物的接触和认识较少。我们通过引入厌氧环境中微生物结构分析等实验项目，使学生有机会接触厌氧箱的使用，掌握厌氧微生物的培养方法等实验内容，进一步丰富实验教学内容，深化实验教学改革。

三、小结

分子生物学技术的发展，展示了一个更为丰富的微生物世界。与目前基于高通量测序的微生物多样性分析方法相比，DGGE技术具有快捷、方便、成本低等优点，适合应用于微生物创新实验教学。通过这些研究性实验的开展，使学生完成无法在正常教学时间进行的实验内容，拓展了与其他学科实验技术的综合应用，在激发学生学习兴趣的同时，不仅提升了学生的实验操作技能和团队协作能力，而且增强了综合思考及分析解决问题的能力，为独立完成毕业论文实验及今后从事科研工作打下了坚实的基础[8]。

参考文献：

[1]张萍华，蒋冬花.微生物学创新实验教学体系的构建与实践[J].微生物学杂志，2013，32（3）：107-109.

[2]袁生，徐旭士，戴传超，何伟，张茵，尚广东，戴亦军.微生物学实验课程的改革与实践[J].高等理科教育，2012，（2）：138-140.

[3]贾艳萍，张兰河，马姣.立足学科发展的微生物学实验教学改革研究[J].实验技术与管理，2012，29（12）：26-32.

[4]李晓然，吕毅，宫路路，柳陈坚.微生物分子生态学发展历史及研究现状[J].中国微生态学杂志，2012，24（4）：366-369.

[5]李琬，李景鹏.分子生物学技术在堆肥微生态研究中的应用研究进展[J].中国农学通报，2012，28（18）：20-25.

[6]王洋清，杨红军，李勇.DGGE技术在森林土壤微生物多样性研究中的应用[J].生物技术通报，2011，（5）：75-79.

[7]高慧琴，刘凌.PCR-DGGE技术中不同DNA提取方法综述[J].安徽农业科学，2011，39（1）：52，102.

[8]高健，周建良，蒋本桂，张洁.普通微生物实验教学全面开放理论的建构[J].当代教育理论与实践，2012，4（3）：113-114.

基金项目：东北林业大学微生物学重点课程建设项目；东北林业大学教育研究课题项目（DGY2011-15）；东北林业大学教育教学研究课题（DGY2012-10）

作者简介：卢磊（1982-），男，讲师，博士，主要研究方向为环境微生物。