DNA 疫苗的药性在动物医学使用

dna疫苗又称基因疫苗或核酸疫苗，1990年Wolff等人首次发现，是将某种蛋白抗原基因重组入某种真核表达载体，再将这种重组表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统,从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。传统疫苗在效力、安全效用方面存在着诸多缺点，例如灭活疫苗不能有效刺激机体产生细胞免疫应答，产生的非保护性抗体更有利于病原的浸染（抗体依赖性增强作用），弱毒疫苗安全性令人担忧，存在返祖反强的潜在危险。DNA疫苗兼有灭活疫苗和弱毒疫苗二者的优点，既可以作为预防性疫苗，也可以作为治疗性疫苗，在生产制备、运输贮存等方面都具有其他疫苗无法比拟的优势，因此被称为第三代疫苗。可以应用于病毒、细菌或寄生虫等感染性疾病的预防,也可作为非感染性疾病、肿瘤、自身免疫疾病、部分病毒感染等的治疗性疫苗。

目前，人们对DNA疫苗的表达水平和免疫原性以及接种途径、佐剂等多方面进行了广泛的研究，应用于临床的DNA疫苗却很少，主要原因是由于大部分DNA疫苗的免疫效果不尽人意，但伴随着生物技术的不断发展，DNA疫苗必定能在未来的疫苗研制中扮演举足轻重的角色。

1DNA疫苗的特点

1.1DNA疫苗的优点

DNA疫苗相对于灭活疫苗，其最大优点就是可以携带不同的保护性抗原基因，构成多价或多联疫苗。病毒感染机体时，体内产生的抗体一部分可以和病毒中和，使其失去感染细胞的能力，另一部分抗体却发挥相反的作用，它们协助病毒感染细胞，这就是所谓的抗体依赖性增强作用，灭活疫苗同样具有这样的特点，因而在很多情况下导致免疫失败，甚至出现注射了疫苗加快发病的现象。DNA疫苗可以人为地去掉非保护抗原，避免抗体依赖性增强作用的出现。DNA疫苗的研制还可以根据质粒载体的特点，在调控元件下插入同种病原不同血清型的抗原基因，形成多价苗，也可以插入不同病原的抗原基因，形成多联苗，这就是所谓的“万能疫苗”。

DNA疫苗不仅能诱导体液免疫，更重要的是产生强有力的细胞免疫，此外，DNA疫苗不受母源抗体的影响，有可能成功地用于幼龄动物乃至新生动物的免疫接种，可广泛用于许多疾病的早期预防，这些都是灭活疫苗不可比拟的。

DNA疫苗相对于弱毒疫苗，DNA疫苗只含部分病原体基因组序列，不会因病原体毒力回升而导致疫苗毒的散播。

1.2DNA疫苗的缺点

尽管DNA疫苗有很多传统疫苗无法比及的优点，但它同样也有缺点，除了DNA疫苗由于表达抗原单一而表现的免疫效果较差外，主要在安全问题上令人担忧。美国FDA在关于DNA疫苗安全性问题上，提出应注意DNA疫苗的局部反应原性和全身毒性、遗传毒性作用、生殖毒性以及致肿瘤性四个方面。WHO在《关于DNA疫苗质量保证指南》中也要求DNA疫苗的研制必须考虑其特殊的安全性问题，主要包括：①可能导致插入性诱变，即质粒载体和外源基因是否会整合进入宿主的基因中；②外源性蛋白长期表达可导致免疫病理，即长期表达外源抗原可能产生机体产生免疫耐受、自身免疫病、过敏反应、超免疫力或自身攻击。③与细胞因子合用可能导致的其他风险；④表达抗原的载体自身可能有其他生物活性。

此外，DNA疫苗所用载体大部分携带抗抗生素基因，这些基因有可能会被其他病原所转化，形成耐药病原，这样造成的“基因污染”对人类社会的确是一种很大的威胁。

2DNA疫苗的免疫机制

目前对DNA疫苗免疫机理的研究仍在探讨中，一般认为，DNA疫苗在接种后，机体对其加工处理过程与病毒感染的自然过程相似，抗原提呈过程也相同。首先，注射部位的组织细胞（如肌细胞、上皮细胞和粘膜细胞）、抗原递呈细胞（APC）或其他炎性细胞将部分质粒摄取，未被摄取的游离DNA大多数被DNA酶降解，少数可能随循环系统而进入淋巴结或脾中；然后，质粒DNA分子在摄取细胞的核内转录为mRNA，再被移至细胞质内翻译成抗原蛋白分子。这些抗原蛋白分子有的被分泌到细胞外，有的结合到细胞膜上或局限于细胞浆内。分泌出细胞外的抗原蛋白分子最终通过胞饮或吞噬作用方式被APC捕获，APC将捕获的抗原蛋白分子进行加工处理，再将处理后的抗原肽递呈给T细胞，启动免疫反应。免疫应答启动后，引发细胞毒性T细胞（CTL）应答，杀死表达外源抗原的肌细胞，使那些没有分泌到细胞外的抗原蛋白分子释放出来，再由APC捕获，启动随后的免疫反应。释放到细胞外的抗原蛋白分子除了被APC捕获外，也可被B细胞识别，从而激活B淋巴细胞产生抗体，这样就诱导了机体的细胞免疫应答和体液免疫应答。

3影响DNA疫苗免疫效果的因素

3.1目的基因的选择

目的基因即DNA疫苗表达的抗原蛋白基因，它的选择非常关键，首先要求是表达出的蛋白分子诱导机体产生的抗体能与病原发生中和反应，即为保护性抗原基因；其次考虑考虑它是否含有密码子，有无内含子以及是否能在哺乳动物细胞中正确剪切等问题；最后，要考虑单一目的基因是否能起到保护作用，是否需要构建多基因表达载体或分别构建表达载体。

3.2载体及启动子的选择

在临床试验中，用不同的质粒载体表达同一段基因，往往会有不同的结果，除了个体差异和接种途径的因素外，载体的选择是非常重要的。用作DNA疫苗的载体要求是首先在哺乳动物细胞内能高水平地表达目的基因，其次本身不复制，不会整合到宿主染色体中，满足这两点才可以应用。决定载体在体内表达的因素，一方面是载体自身序列，不同的载体所含的酶切位点也不同，进入机体后降解的程度也有差异；另一方面与启动子有关，控制外源基因表达的启动子对载体的影响最大。目前DNA疫苗中所用的质粒载体均含有真核生物启动子，如呼吸道合胞病毒(RSV)，SV40和CMV的启动子以及人b肌动蛋白启动子等，启动子的选择主要是考虑其强弱和来源，根据其来源，启动子有组织特异性，在各种组织中，起始mRNA合成的效能也不同。

3.3佐剂的应用

目前，应用于DNA疫苗的佐剂类型较多，有细胞因子、趋化因子、协同刺激分子、脂质体、寡脱氧核苷酸、补体分子以及霍乱毒素等佐剂。最常用的为细胞因子，如TNF、GM-CSF、IFN以及IL-2、IL-4和IL-12等，在与核酸疫苗共同接种时，常能明显提高体液和细胞免疫反应。趋化性细胞因子是一种新型智能型疫苗佐剂，能通过募集特定细胞诱导调节针对DNA疫苗或肿瘤抗原诱发的特异性免疫反应，例如TCA3、MIP（炎性因子）等。协同刺激分子是淋巴细胞识别APC提呈的抗原过程中的一系列辅助分子，如B7/CD28、CD40-CD40L等就属于这种辅助分子。脂质体是人工制备的类脂质小球体，可以包裹DNA疫苗进入细胞，减少降减。寡脱氧核苷酸是一种免疫刺激DNA序列，能直接激活B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、抗原提呈细胞等，间接激活T细胞、NK细胞，诱导以Th1型为主的免疫应答，是一种高效低毒的新型免疫佐剂。补体分子佐剂如C3d，是补体系统中补体C3的裂解产物之一，可通过特异性补体受体2（CR2/CD21）将抗原信号提供给免疫细胞，增强特异性免疫应答。近年发现霍乱毒素是一种良好的核酸免疫佐剂，Arrington等将编码霍乱毒素和大肠杆菌不耐热肠毒素的A和B亚单位克隆入两个表达载体，与核酸疫苗一起以粒子介导的方式免疫动物的表皮，发现明显的增强了针对多种病毒抗原的TH1型细胞免疫，此外，TH2型免疫应答也增强。

免疫佐剂的使用，使DNA疫苗的应用趋于成熟，新型的低成本高效DNA疫苗佐剂仍然是目前研究的热点。

3.4接种途径和剂量

DNA疫苗的接种途径会直接影响其免疫效果，根据DNA疫苗的免疫机制，它在机体主要是进入肌细胞、上皮细胞和黏膜细胞等中表达，从而发挥作用，故接种的部位也是选择富含这些细胞的位置。有研究比较了经肌肉、静脉、鼻腔、真皮、皮下和腹腔等不同途径接种DNA疫苗（甲型流感病毒HA基因）后的免疫效果，结果除腹腔注射外，都产生了一定保护作用，但以肌肉和静脉注射效果最好，肌肉摄入和表达DNA的能力比其它组织高100～1000倍。目前多选择肌肉多点注射，或肌肉注射与皮下、鼻腔免疫相结合的方式进行免疫，效果相对较好。

比较注射方法，基因枪接种比直接注射核酸疫苗效果好甚至上几千倍，但操作相对烦琐，临床中不易实现。

3.5机体自身因素

由于动物个体之间的差别，相同的DNA疫苗采用相同的接种方式也会出现不同的免疫效果，有的甚至出现免疫耐受的情况，不过这种现象只出现在部分个体中。作者认为，机体自身因素导致DNA疫苗免疫效果各异的最主要原因却是机体与疫苗之间的相互作用，主要是指体内局部位置含有的DNA降解酶是否会对DNA疫苗载体以及目的基因发生破坏作用，体内是否会对DNA疫苗产生RNA干扰效应，导致外源基因表达沉默，这是我们以后研究的一个重点方向，也可能是DNA疫苗免疫效果不确实的最主要原因。

4DNA疫苗在动物医学中的应用

鉴于DNA疫苗的优越性，国内外学者对各种细菌、病毒、寄生虫的DNA疫苗进行了大量研究，并在预防畜禽传染病中取得了良好效果，有的已步入临床应用阶段，为动物疫病的防控又注入了新的血液。下面简单介绍动物用DNA疫苗的部分情况。

4.1应用于禽类的DNA疫苗

DNA疫苗已广泛用于禽流感、新城疫、鸡马立克氏病、鸡传染性喉气管炎、鸡传染性法氏囊病、鸡传染性支气管炎以及鸭乙肝等禽类病毒性疾病的预防性研究，根据病毒的不同，选择不同的保护性抗原基因，并分别取得了不同的免疫效果。

4.2应用于猪的DNA疫苗

研究最多的最数猪呼吸与繁殖综合征病毒（PRRSV）DNA疫苗，大多数人选择几个结构蛋白基因作为保护性抗原基因，免疫效果也不尽相同。猪口蹄疫、猪流感、猪瘟、伪狂犬病等疾病的DNA疫苗研究也十分火热，针对不同疾病的DNA疫苗也呈现不同的保护作用，但遗憾的是能应运于临床中的DNA疫苗却少之又少。

4.3应用于其他动物的DNA疫苗

有学者发现用gD质粒DNA疫苗免疫新生犊牛，不受母体母源抗体的影响，免疫效果很好。对牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）的DNA疫苗的研究也取得一定进展，免疫了含有BRSV重组C基因的质粒DNA的牛，在BRSV攻击后，病毒量显著减少。

此外，狂犬病、犬细小病毒、犬瘟热、猫白血病、猫免疫缺陷等疾病的DNA疫苗研究也都取得了一定进展，有的研究进行了攻毒试验，有的没有攻毒，却也能检测到较强的细胞免疫应答和中和抗体，这对兽医工作者来说，无疑是一种喜讯。

5小结

目前，尽管DNA疫苗的作用机理还不十分清楚，它的安全性还有待于进一步研究，但它的潜在优势已不容置疑。在人类临床上，已用于部分肿瘤及非感染性疾病的基因治疗，动物临床上，DNA疫苗也日益显示出它的优势，尤其是针对各种病毒感染性疾病，研究与应运的也越来越多，它无疑比传统疫苗更具有优势，相对重组病毒疫苗则更具安全性。但DNA疫苗免疫效果相对较差是扼制其发展的一个瓶颈问题。从影响DNA疫苗免疫效果的因素中寻找原因，多数的研究只是把佐剂的选择作为重点去探索，很少考虑到疫苗与机体的相互作用。

作者认为，既然目的基因和载体的选择对DNA疫苗免疫效果产生影响，那么就须考虑以下问题：DNA疫苗进入机体虽然构不成完全抗原，但作为异源物质，机体是否会产生一种抗DNA的“抗体”，从而降低了它的效应？体内的各种酶对DNA疫苗质粒的降解作用如何？是否存在RNA干扰效应？这是我们将后来重点解决的问题。

总体讲，DNA疫苗在动物疫病的防控中是有积极意义的，随着研究的不断深入，相信将来有一天，DNA疫苗可以突破其劣势的一面，向着更安全、更低廉、更有效的方向发展，在所有疫苗中扮演举足轻重的角色，促进我国畜禽养殖业的发展。