银杏外种皮双黄酮类化合物银杏黄素定性与定量检测

[摘要] 目的：为了对银杏外种皮不同提取分离工艺得到的产品中银杏黄素进行定性和定量检测。方法：采用TLC法，以氯仿-苯-丙酮-甲酸（3∶5∶1.5∶1.5）为展开剂进行展开，分离银杏外种皮双黄酮类化合物，并用HPLC法进行含量测定。结果：银杏外种皮双黄酮类化合物可达到较好的分离检测效果。结论：本法简便、准确、重现性好，可用于银杏外种皮双黄酮类化合物的分离和含量测定。

[关键词] 银杏外种皮；双黄酮类化合物；银杏黄素

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A[文章编号]1673-7210（2010）10（c）-052-03

Qualitative and quantitative detection of Biflavonoids-ginkgetin in Testa of Ginkgo biloba L.

SONG Guobin, XI Guoping

(The Medical College of Datong University, Datong 037009, China)

[Abstract] To establish a method for the separation and content determination of Ginkgetin in Testa of Ginkgo biloba L.. Methods: Biflavonoids was separated from Testa of Ginkgo biloba L. by TLC. The developing solvent consisted of chloroform, benzene, acetone and methane acid (3∶5∶1.5∶1.5). The content determination of Biflavonoids in Testa of Ginkgo biloba L. was by HPLC. Results: The Biflavonoids in Ttesta of Ginkgo biloba L. were separated well by TLC. Conclusion: The method is fast, reliable, accurate and can be used in the separation and content determination of Biflavonoids in Testa of Ginkgo biloba L..

[Key words] Testa of Ginkgo biloba L.; Biflavonoids; Ginkgetin

银杏外种皮是银杏果仁的皮层，即种子硬壳外面的肉质皮层，俗称白果衣胞。银杏外种皮中含有黄酮类化合物，只是含量较银杏叶低，其中主要是双黄酮类化合物。已报道的有金松双黄酮、银杏黄素、异银杏黄素、5′-甲氧基白果素和白果素[1]。本实验采用TLC和HPLC法，确实合适的检测条件，对银杏外种皮不同提取分离工艺得到的产品中银杏黄素进行定性和定量检测。

1 仪器与试药

1.1 仪器

RE-25型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；METTLER-AE240型电子天平（瑞士梅特勒公司）；LABCONCO冷冻真空干燥器（上海泽权仪器设备有限公司）；荧光灯（上海公私合营泸江仪器厂）；高效液相色谱仪Beckman 100（美国贝克曼公司）；C-RIB 数据处理仪（日本岛津公司）。

1.2 试药

银杏外种皮（贵州省贵阳市乌当区杨昌镇）；大孔吸附树脂（DM-130，山东鲁抗医药集团股份有限公司）；硅胶G（上海五四化学试剂有限公司）；其他化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 银杏外种皮粗提物的制备

银杏外种皮晒干、粉碎，在70℃，7倍体积的60%乙醇（W/V）条件下，提取4次，合并提取液，用旋转蒸发仪在50℃减压浓缩，干燥，备用。

2.2 柱层析

层析柱尺寸：φ55 mm×H800 mm，将处理好的DM-130大孔吸附树脂湿法装柱，装柱高度600 mm。把粗提物配制成黄酮浓度为2.5 mg/ml左右的70%乙醇溶液，过滤，上样。先用水洗至流出液无色，换用90%乙醇洗脱，用量为4～5倍树脂体积，收集洗脱液，浓缩至无乙醇味后，冷冻干燥得粗产品。

2.3 银杏外种皮双黄酮类化合物检测

2.3.1 双黄酮类化合物TLC定性检测硅胶G薄板（2.5 cm×7.5 cm），点样2 μl，展开剂：氯仿-苯-丙酮-甲酸=3∶5∶1.5∶1.5，晾干后，喷5%氯化铝（70%乙醇配制），然后在365 nm的荧光灯下观察斑点情况，黄绿色斑点即为双黄酮类化合物[2]。

2.3.2 双黄酮类化合物对照品制备称取银杏外种皮100 g，于50℃用400 ml 60％丙酮水溶液回流提取4次，合并提取液，过滤，用正己烷萃取至正己烷相无色。在40℃将萃取过的提取液真空浓缩至200 ml，于4℃放置浓缩液12 h，再离心分离水洗沉淀，至水相基本无色，将沉淀用甲醇溶解，作为点样液，按“2.3.1”项下检测方法，可以清晰地看到3个黄绿色斑点，然后将点样液点于制备型硅胶G薄板（10 cm×15 cm）， 以“2.3.1”项下展开剂展开，在荧光灯下划出黄绿色斑点对应的区带，然后刮板，将相同的区带合并，装成小柱，以氯仿-甲醇=1∶1为洗脱剂洗脱，浓缩洗脱液，分别装于3个小瓶内，待测[3]。

2.4 双黄酮类化合物HPLC定量检测

2.4.1 色谱条件色谱柱：ODS 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；进样量：20 μl；流动相：甲醇-水-甲酸（85∶15∶0.8）；检测波长：254 nm；流速：1 ml/min；柱温：室温。

2.4.2 色谱分析将“2.3.2”分离所得3种双黄酮类化合物溶液分别进样测定，确定对应的保留时间，称取相同重量的粗提物和大孔吸附树脂分离后的产品，用70%乙醇溶解，定容至25 ml，用“2.4.1”色谱条件进行HPLC测定，用保留时间确定峰的归属，用峰面积比较相对含量。

2.5 结果

2.5.1 双黄酮对照品的TLC鉴定将按“2.3.2”项下制备的双黄酮类化合物对照品于规格为2.5 cm×7.5 cm的硅胶板上点样，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸＝5∶4∶1为展开剂展开，在365 nm的荧光灯下观察。在所给实验条件下每种黄酮类化合物均只有一个斑点；标记各斑点的中心位置，计算Rf值（表1）。据许沧等[4-8]报道，Rf值为0.47的斑点为银杏双黄酮类化合物――银杏黄素。

表1 3种银杏外种皮双黄酮类化合物Rf值

Tab.1 Rf values of three Biflavonoids in the Testa of Ginkgo biloba L.

2.5.2 双黄酮对照品的HPLC纯度验证按“2.4.1”色谱条件分别检测上述3种双黄酮类化合物，每种化合物均只有一个对应峰。结果表明，分离得到的黄酮类化合物为单一物质。见图1～3。

TLC、HPLC试验结果显示，TLC-2号带的Rf值与文献报道银杏双黄酮类化合物――银杏黄素的Rf值一致，且HPLC分析只有一个峰，因此确定2号带为银杏双黄酮类化合物银杏黄素。

2.5.3 不同工艺产品中双黄酮类化合物银杏黄素的检测

2.5.3.1双黄酮类化合物银杏黄素TLC检测称取大孔吸附树脂分离所得产品0.44 g，用70%乙醇溶液溶解，定容至25 ml，同时称取相同重量的粗提物，用70%乙醇溶解，定容至25 ml，在硅胶板（2.5 cm×7.5 cm）同时点上银杏黄素对照品溶液、粗提液、树脂分离后产品溶液，按“2.3.1”检测方法，观察样液的斑点并与对照品的相应斑点比较Rf值、斑点的大小和颜色深浅，以确定斑点的归属和相对含量。结果表明，大孔吸附树脂分离后的产品中银杏黄素斑点的面积和颜色深度都明显超过银杏外种皮粗提物。

2.5.3.2 双黄酮类化合物银杏黄素 HPLC检测按“2.4.1”色谱条件分别检测“2.2”中粗提物和树脂分离后产品中银杏黄素，以银杏黄素的峰面积作相对含量比较。见表2，图4、5。

表 2 不同产品中银杏黄素的含量比较

Tab.2 The relative content of Ginkgetin in different products

3 讨论

本文通过TLC和HPLC方法对银杏外种皮不同提取分离产物中双黄酮类化合物银杏黄素进行了定性检测以及相对含量分析，因标准品昂贵，而黄酮类化合物种类繁多，性质相近，分离极其困难，故对于银杏外种皮双黄酮类化合物提取、分离研究，尤其是银杏黄素而言，在没有标准品的情况下，用TLC和HPLC方法，可以对产品中双黄酮类化合物进行有效的定性、定量分析检测。

除银杏黄素外，实验过程中分离到另外两种双黄酮类化合物，HPLC检测也都只有一个峰。TLC实验显示，这两种黄酮类化合物的在检测到的黄酮中占有很大比例，那么这两种物质到底是哪种双黄酮类化合物，将有待于进一步证实。

[参考文献]

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[2]朱奕庆.银杏研究与应用[M].贵阳:贵州科技出版社,2000:189,217.

[3]吴惠勤,谢培山,张桂英,等.南雄银杏叶中银杏黄酮含量的HPLC测定[J].分析测试学报,2001,20(6):53-54.

[4]许沧,张成英,罗涛.银杏叶中有效成分的提取及鉴定[J].四川省卫生管理干部学院学报,2001,20(1):8-9.

[5]郑佩,盛建国,赵义,等.银杏叶中黄酮化合物的研究[J].天然产物研究与开发,2009,21(B05):11-12.

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[7]Zhang DQ, He ZF.银杏叶资源化学研究[M].Beijing: China Light Industry Press,1999:50-56.

[8]Teris A, Van B. Chemical analysis of Ginkgo biloba leaves and extracts [J]. Journal of Chromatography A,2002,96(7):21-55.

（收稿日期：2010-08-12）