鹿茸多肽的药效分析

摘要:文章探讨了鹿茸多肽对β淀粉样蛋白诱导脊髓神经元细胞凋亡的保护作用。

关键词:鹿茸多肽;作用;分析

中图分类号:R194文献标识码:A文章编号:1007-9599 (2010) 01-0000-01

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是外科常见的创伤,其年发病率逐年升高。在脊髓损伤中,除了原发的物理打击因素造成神经细胞损伤外,已发现损伤区及临近部位的神经细胞存在迟发性的死亡现象,这种死亡与常见的坏死不同,表现为一种程序性死亡(细胞凋亡),细胞凋亡可能参与了脊髓损伤的病理生理过程。Caspase3是凋亡过程中最重要的蛋白酶,降低其的表达有助于脊髓损伤的修复和再生。鹿茸系鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生绒毛的幼角。关于鹿茸多肽混合物,近两年,有学者通过实验证明鹿茸多肽对脊髓损伤后的神经细胞有保护作用,本实验应用鹿茸多肽作用于β淀粉样蛋白诱导的脊髓神经元细胞凋亡的保护作用,以进一步阐述其对脊髓神经细胞保护作用的机理。

一、实验材料

15d孕鼠购自吉林大学实验动物中心;DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自invitrogen公司;细胞培养瓶和培养板购自Castar公司;神经生长因子(NGF)购自Sigma公司;鹿茸多肽由长春中医药大学惠赠;β淀粉样蛋白(Aβ25-35)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自(Sigma公司);兔多克隆caspase3抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

二、实验方法

(一)凝聚态Aβ25-35的制备用超纯水将冻干的Aβ25-35溶解配成100μmol/L的储存液,于-20℃保存,使用前配成所需浓度,于37℃孵育24h备用。

(二)胎鼠脊髓细胞悬液制备及培养取孕15d大鼠,10%水合氯醛腹腔麻醉后,无菌状态下取出胎鼠。用Hank's液冲洗数遍后,放于培养皿中。在解剖显微镜下从背侧完全暴露脑干以下整条脊髓,从正中沟处用钨丝针切除双侧脊髓的后外侧部。将取下的脊髓腹侧组织,经Hank's液冲洗后,剥去表面的血管等,用显微剪子细剪切成糜状,越细越好;然后用0.25%胰酶37℃消化20min后,用吸管轻轻吹打数次,经200目滤网过滤,离心弃上清,用含15%胎牛血清培养基以1×106/ml接种于塑料培养瓶中。

将细胞培养在含15%胎牛血清、100U/ml氨苄青霉素及100U/ml链霉素的DMEM培养基中,于37℃、饱和湿度、5 %CO2浓度下培养,2～3d换液一次。实验均取对数生长期细胞,实验前12h细胞换用无血清培养液,观察不同浓度Aβ25-35的作用。

(三)MTT比色法检测。细胞活力观察不同终浓度(0、5、10、20、25、30μmol/L)的Aβ25-35作用24h后,细胞活力的变化,细胞接种于96孔板24h后加入不同浓度的Aβ25-35作用24h,每个浓度设4个复孔L,同时设与实验孔平行的空白对照,最后比色时以对照孔调零。共同孵育24h后更换培养基,每孔加入180μl的培养基和20μl的MTT(5mg/ml),置37℃、5%CO2培养箱培养4h,弃培养液,每孔加入200μlDMSO,37℃孵育30min,至结晶物充分溶解。在多功能酶标仪上测定570nm的吸光度(D570),其与对照吸光度的比值作为相对细胞活力。

(四)流式细胞仪检测。将细胞接种于24孔板,待达到80%融合时,按下列分组进行实验:A.对照组,B.Aβ25-35(25μmol/L),C.Aβ25-35(25μmol/L)+鹿茸多肽(400mg/ml)[3],D.照射Aβ25-35(25μmol/l)+NGF(20ng/ml)组。各组均6复孔。将24h以后各组细胞用0.25%胰蛋白酶消化,1000r/min离心5min,弃上清;用500μl5mmol/LEDTA/0.01mol/LPBS洗涤细胞;再加入50μl10g/LRNaseA,室温下孵育30min;最后加入500μl100mg/LPI染色液,旋转混匀,置4℃避光孵育30min后,流式细胞仪测定。

(五)免疫细胞化学染色。将1cm×lcm盖玻片经浸酸及消毒等处理后,放入24孔培养板中,加入10倍稀释的多聚赖氨酸液,置于CO2孵箱中1h;弃去多聚赖氨酸液,用DMEM培养基洗一次,将各组细胞悬液分别接种于各孔,继续培养24h;弃去原培养液,用37℃预热的0.1mol/LPBS轻洗3次;余按免疫组织化学试剂盒说明操作。

三、统计方法

应用统计分析软件SPSS14.0分析数据,数据以均数±标准差(x±s)表示,两两比较采用t检验,P

四、结果

(一)脊髓神经元细胞的培养及鉴定。单细胞悬液接种后第2d,细胞聚集成团状,第3d出现大量悬浮的neurosphere(约30-60个细胞),而且neurosphere越来越多。到第7d细胞胞体十分饱满,轮廓清晰,有的细胞可见明显的鸟眼状细胞核,也有的细胞伸出树枝状突起,突起相互连成网络。用神经元特异烯醇化酶(NSE)标记神经元。镜下观察,可见实验组细胞胞体饱满,突起明显并连成网状。

(二)流式细胞仪检测结果。以400mg/ml剂量观察鹿茸多肽对Aβ25-35诱导脊髓细胞凋亡的抑制作用,并用NGF作为对照。结果显示,Aβ(25μmol/L)+鹿茸多肽(400mg/ml)组细胞凋亡百分数是19.35±6.74与Aβ组凋亡百分数37.42±12.55比较,有显著性差异,P

(三)免疫组化检测caspase3结果caspase3阳性细胞胞质着棕色。结果显示:对照组无caspase3阳性染色的细胞;Aβ(25μmol/L)+鹿茸多肽(400mg/ml)组caspase3阳性细胞数减少,比单纯Aβ(25μmol/L)组少,其作用与NGF阳性对照组比较无差异,鹿茸多肽对脊髓细胞凋亡具有抑制作用。

五、讨论

脊髓损伤的治疗是神经科学领域内一道尚未解决的难题,虽然人们采取了许多种方法促进损伤后的脊髓轴突再生修复,但存在许多限制因素,很难达到理想效果,许多学者进行了深入研究脊髓神经组织损伤后再生不良,其重要原因是伤后继发性损害不断加重所致,而细胞凋亡是继发性损伤的关键,抑制细胞凋亡是阻止或减少继发性损伤,保护神经功能的治疗所在。

实验结果显示:应用Aβ25-35诱导胎鼠脊髓神经元细胞凋亡后,在细胞中加400mg/ml鹿茸多肽后,通过MTT比色法检测细胞活力、流式细胞仪检测细胞凋亡数目和免疫组化观察caspase3表达量下降,提示,鹿茸多肽具有抑制Aβ25-35诱导脊髓神经细胞凋亡的作用,其作用是通过调控凋亡基因的表达,即caspase3表达下调而实现的。本实验说明,鹿茸多肽主要是通过有效地降低死亡蛋白酶caspase3的表达量,进而抑制脊髓神经元细胞的凋亡起到保护脊髓神经元细胞的作用。