EGFR与CK20 mRNA在卵巢上皮性肿瘤中的表达及意义

【摘要】 目的研究表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor, EGFR) 和细胞角质蛋白20(cytokeratin-20,CK20)在卵巢上皮性肿瘤中的表达及相关性,探讨二者在卵巢肿瘤发生、发展和转移中的作用。方法 应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测12例正常卵巢(对照组)、18例卵巢良性肿瘤(良性组)、33例卵巢癌(恶性组)组织中EGFR 、CK20 mRNA的表达,分析其与临床病理特征的关系。结果 卵巢癌组织中EGFR mRNA和CK20 mRNA的阳性表达率显著高于正常卵巢及卵巢良性肿瘤组织(P

【关键词】 卵巢癌;表皮生长因子受体;细胞角质蛋白 20;逆转录聚合酶链式反应

Expression and Significance of EGFR and CK-20 in Ovarian Carcinoma

ZOU Zhong-xiang,XU Jie,SHA Xiu-min,et al.

Department of Obstetrics and Gynecology,Yantai City Laiyang Central Hospital,Laiyang 265200, China

【Abstract】 Objective To investigate the expression and significance of epidermal growth factor receptor (EGFR) and cytokeratin-20 (CK20) in ovarian epithelial tumor, and to explore their roles in the tumorigenesis, development and metastasis of ovarian tumor. Methods The expression of EGFR and CK20 were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) in 12 cases of normal ovary tissue, 18 cases of benign ovarian tumor and 33 cases of primary ovarian carcinoma. Analyzed the relationship between the two genes and the different clinicopathological features. Results The positive rates of EGFR mRNA mRNA and CK20 mRNA were significantly higher in m alignant ovarian specimens than that in the normal and benign ones (P

【Key words】 Ovarian carcinoma;Epidermal growth factor receptor; Cytokeratin-20;Reverse transcription polymerase chain reaction

作者单位:265200 山东省烟台市莱阳中心医院妇产科(邹忠香 徐杰);烟台市莱阳中心医院普外科(张素华);烟台市蓬莱人民医院普外科(沙秀敏)

卵巢癌是妇女常见的恶性肿瘤之一,近20年来卵巢癌的发病率有上升的趋势,其死亡率已居各类妇科肿瘤的首位[1]。卵巢癌具有临床发现晚、转移早、治疗效果不好等特点,多数患者就诊时已处于疾病的晚期阶段。研究指出卵巢癌的侵袭转移是多基因协调作用的结果,但是目前仍然不清楚卵巢癌发生发展和侵袭转移的具体分子机制。研究和寻找有关卵巢癌诊断、转移及复发的生物学标记物对于指导治疗、提高术后生存率有十分重要的意义。本研究应用RT-PCR检测EGFR与CK20在不同卵巢组织中的表达及相关性,探讨二者作为卵巢癌肿瘤细胞标志的可能性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院2004年4月至2007年10月卵巢上皮性肿瘤手术切除标本51例,经病理组织学证实。其中卵巢良性肿瘤18例(浆液性肿瘤10例,粘液性肿瘤8例),卵巢癌33例(卵巢浆液性癌24例,卵巢粘液性癌9例)。另取同期12例子宫肌瘤患者手术切除的部分卵巢正常组织作为对照。患者年龄21～75岁。卵巢恶性肿瘤临床分期按照FIGO分期标准,其中Ⅰ期7例,Ⅱ期5例,Ⅲ期14例,Ⅳ期7例,患者术前均未进行化疗和放射治疗。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及处理 所有标本手术后0.5~1 h迅速取组织冻存于-70℃冰箱备用。

1.2.2 主要试剂及引物 总RNA提取液、RT-PCR试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司。从Genbank中查到CK20、EGFR及内参照基因GAPDH的基因序列,采用PCGENE软件设计出引物如下:CK20 mRNA上游引物:5’-CAGACACACGGTGAACTATGG-3’,下游引物:5’-GATCAGCTTCCACTGTTAGACG-3’,扩增片段370bp;EGFR mRNA 上游引物5’-AACACAGTGGAGCGAATTCCTTT -3’,下游引物5’- GGAAGTCCATCGACATGTTGCT -3’,扩增片断262bp;GAPDH mRNA 上游引物5’-TCATGGGT GTGAACCATGAGAA-3’,下游引物5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG -3’,扩增片断146bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文

1.2.3 总RNA提取 按RNA抽提操作手册(大连宝生物工程公司)的方法提取组织总 RNA。提取的RNA 经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性,通过紫外分光光度计测定260 nm与280 nm吸光度值而计算RNA的纯度与浓度。

1.2.4 逆转录反应,cDNA的合成 反应体系:dNTP Mixture 1ul,Template RNA 1 μg, RNase Free dH2O至10ul,65℃孵育5 min后置于冰上,加入5×Prime Script Buffer 4 μl, RNase Inhibitor 0.5 μl, Prime Script RTase 0.5ul,RNase Free dH2O 5ul, 30℃10 min,42℃20 min,95℃5 min后置于冰上。逆转录出的cDNA用于PCR反应或于-20℃保存备用。

1.2. 5 聚合酶链式反应 取上述逆转录反应液2 μl,加入10×PCR Buffer 2 μl,dNTP Mixture 0.8 μl,TaKaRaExTaqHS 0.2 μl,上下游引物各1 μl,RNase Free dH2O 13 μl。CK20反应条件:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,63℃退火1 min,72℃延伸30 s,循环35次。EGFR和GAPDH反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸7 min。反应产物取10 μl行2%琼脂糖凝胶电泳,溴乙啶染色,紫外光下照相记录。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。率的比较采用χ2检验和Fisher精确概率法, EGFR、CK20表达的相关性用非参数Spearman等级相关处理。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常卵巢及卵巢上皮性肿瘤组织中EGFR、CK20 mRNA及内参照GAPDH mRNA的电泳结果 EGFR、CK20 mRNA及内参照基因GAPDH mRNA的PCR扩增片断分别为262bp、370bp和146bp。所有的正常卵巢及卵巢上皮性肿瘤组织中均有内参照基因GAPDH的表达(图1, 2)。

图1 EGFR mRNA在不同卵巢组织中表达的电泳结果

M:DNA Marker; 1~5:正常卵巢、卵巢良性肿瘤和癌中GAPDH mRNA的表达;6~7:EGFR mRNA在卵巢癌中的表达;8~9:EGFR mRNA 在卵巢良性肿瘤中的表达;10:正常卵巢组织中EGFR mRNA 的表达;11:阴性对照(262bp处为EGFR mRNA,146 bp处为GAPDH mRNA)

图2 CK20 mRNA在组织中表达的电泳结果

M:DNA Marker; 1~3:卵巢癌组织中CK20及GAPDH mRNA的表达;4~5:卵巢良性肿瘤组织中CK20及GAPDH mRNA的表达;6:正常卵巢组织中CK20及GAPDH mRNA的表达;7:阴性对照 (370bp处为CK20 mRNA,146 bp处为GAPDH mRNA)。

2.2 正常卵巢、良性卵巢肿瘤、卵巢癌组织中EGFR与CK20 mRNA的表达 EGFR mRNA在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤、卵巢癌中的阳性表达率分别为16.7%、22.2%和72.7%。卵巢癌组织中EGFR的阳性表达率显著高于正常卵巢及卵巢良性肿瘤(P

表1

EGFRmRNA和CK20 mRNA在不同卵巢组织中的表达

组别 例数EGFRmRNA 阳性CK20mRNA阳性

n% P值n%P值

正常卵巢组织 12216.7 0.001* 000.008*

卵巢良性肿瘤 18422.2 0.001* 3 16.7 0.035*

卵巢癌33 2472.7 16 48.5

注:*同卵巢癌比较,P

表2

EGFR 和CK20 mRNA表达与卵巢癌患者临床病理特征的关系

临床病理参数 例数EGFRmRNA 阳性CK20mRNA阳性

n% P值n%P值

年龄

≥51 1611 68.8637.5

组织学分型

粘液性癌 95 55.60.212777.80.057

浆液性癌2419 79.2937.5

细胞学分级

高/中分化221777.3 0.438 1254.5 0465

低分化11 763.6436.4

手术病理分期

I-II期12 6 50.00.027325.00.028

III-IV期2118 85.7 13 61.9

淋巴结转移

无231565.20.217 834.80.026

有10 990.08 80.0

2.3 EGFR及CK20 mRNA表达与卵巢癌患者临床病理特征的关系

卵巢癌组织中EGFR mRNA的表达与患者年龄、组织学分型、细胞学分级及淋巴结转移无关(P>0.05),但其表达与FIGO分期有关(P

2.4 卵巢癌组织中EGFR、CK20表达之间的关系 33例卵巢癌组织中, CK20与EGFR共阳性表达16例,共阴性表达8例。经Spearman等级相关分析发现CK20与EGFR之间呈正相关(P=0.014)。

3 讨论

EGFR是由C-erbB-1基因编码的一种糖蛋白的跨膜受体,它的激活可引发更多的癌蛋白激活,在肿瘤的发生发展中起重要作用。肿瘤可以自分泌或旁分泌的形式产生EGF、TGF-α (transforming growth factor )等特异配体,促进肿瘤细胞的增殖 、粘附 、转移以及血管生成,抑制肿瘤细胞的凋亡,进而促进EGFR高表达肿瘤的进展[2]。临床研究显示,大多数恶性肿瘤如肺癌、乳腺癌、结肠癌等都有一定程度的EGFR高表达,而且在分化低、有转移的病例EGFR的阳性率明显增高[3,4]。在卵巢癌中,有学者研究表明70 %~100 %的卵巢癌组织中有EGFR 高水平表达[5]。Tomov S等[6]采用免疫组化方法研究了EGFR在良、恶性卵巢肿瘤中的表达情况,结果发现恶性卵巢组织EGFR的表达率显著高于良性组织,差别有显著性意义;有腹水和进展期的患者其EGFR表达率更高。EGFR高表达肿瘤患者预后差,易发生转移,复发时间短,复发率高,存活期短[7]。本研究中发现卵巢癌组织中EGFR mRNA阳性表达率明显高于良性和正常卵巢组织(P0.05),而与患者手术病理分期有关(P

本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文

CK20是细胞角蛋白家族中发现最晚的一个亚型,是一类水溶性聚合多肽。它非常局限在胃肠道上皮细胞,正常淋巴组织、血液组织,骨髓组织不表达,在大肠癌中高表达。且在肿瘤侵袭、转移、扩散到其他组织器官时,始终保持稳定,从而使CK20 成为一种新的肿瘤诊断标志物。有研究发现[8],对肿瘤组织的切片染色中,原发及转移的结肠癌、胃腺癌、卵巢粘液腺癌、泌尿道移行上皮癌、胆囊和胆管腺癌、胰管细胞腺癌等肿瘤表现为CK20阳性。本研究中,我们检测到CK20在正常卵巢组织中无表达,在卵巢癌中阳性表达率为48.5%(P

本研究结果发现在卵巢癌组织中,CK20与EGFR有显著正相关关系(P=0.014),因此认为二者的阳性表达可能与卵巢癌的发生、发展和转移有一定关系,然而因本组病例例数较少,尽管统计学分析有显著性意义,但EGFR和CK20能否看作一个很有用的生物学指标还有待进一步研究。

参 考 文 献

[1] 连利娟.林巧稚妇科肿瘤学.人民卫生出版社,2006:551.

[2] Sibilia M,Fleischmann A,Behrens A,et al.The EGF receptor provides an essential survivalsignalforSOS-dependent skin tumor development .Cel1,2000,102(2):211-220.

[3] Slichenmyer WJ,Fry DW.Anticancer therapy targeting the erbB family of receptor tyrosine kinases.Semin Oncol,2001,28 (5 Suppl 16):67-79.

[4] Herbst RS,Langer CJ.Epidermal growthfactor receptors as a target for cancer treatment:the emerging role of IMC-C225 in the treatment of lung and head and neck cancers.Semin Oncol,2002,29 (1 Suppl 4):27-36.

[5] Nielsen JS,Jakobsen E,Holund B,et al.Prognostic significance of p53,Her-2,and EGFR overexpression in borderline and epithelial ovarian cancer.Int J Gynecol Cancer,2004,14 (6):1086-1096.

[6] Tomov S,Popovska S,Veselinova T,et al.Immunohistochemical analysis of epidermal growth factor receptors expression in m alignant ovarian tumors [Article in Bulgarian].Akush Ginekol (Sofiia),2005,44 (Suppl 2):42-47.

[7] Psyrri A,Kassar M,Yu Z,et al.Effect of epidermal growth factor receptor expression level on survival in patients with epithelial ovarian cancer.Clin Cancer Res,2005,11(24 Pt 1):8637-8643.

[8] Moll R,Lowe A,Laufer J,et al.Cytokeratin 20 in human carcinomas.A new histodiagnostic marker detected by monoclonal antibodies.Am J Pathol,1992,140(2):427-447.

[9] Rotern D,Cassel A,Lindenfeld N,et al.Urinary cytokeratin 20 as a marker for transitional cell carcinoma.Eur Urol,2000,37(5):601-604.

本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文