桂皮醛对口腔鳞状细胞癌细胞抑制作用的体外研究

【摘要】目的：体外研究中药桂皮醛对口腔鳞状细胞癌细胞增殖的抑制作用。方法：以3种人口腔鳞状细胞癌细胞株为研究对象，采用噻唑蓝（MTT）比色法观察桂皮醛不同质量浓度、不同作用时间下对各细胞株增殖的影响。应用SPSS　16.0软件对数据进行方差分析。结果：与空白对照组相比，256、128、64、32mg·L-1质量浓度组的桂皮醛对人口腔鳞状细胞癌细胞的增殖表现出明显抑制作用，且抑制作用随着药物质量浓度的升高而加强，呈现明显的剂量-效应关系。药物作用时间24h时，作用质量浓度16mg·L-1时，对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株抑瘤率达到58.33％；作用质量浓度为32mg·L-1时对KB细胞及人颊黏膜鳞状细胞癌BCaCD885细胞株的抑制率分别为66.08％、76.61％，其抑制率随着药物作用时间的延长而增加。结论：桂皮醛对口腔鳞状细胞癌细胞增殖的抑制作用与质量浓度和作用时间有关，中、高浓度的桂皮醛对3种人口腔鳞状细胞癌细胞增殖均具有明显的抑制作用，在一定程度上肯定了桂皮醛的抗肿瘤作用。

【关键词】桂皮醛；口腔鳞状细胞癌细胞；噻唑蓝

【中图分类号】R739.8

【文献标志码】A

桂皮醛别名为肉桂醛，具有抗炎、抗菌、诱导肿瘤细胞凋亡等多种作用。目前有关桂皮醛对口腔鳞状细胞癌细胞影响的报道较少。本研究旨在探讨桂皮醛对人口腔鳞状细胞癌细胞株生长的影响，以期能进一步验证桂皮醛的抗肿瘤活性。

1　材料和方法

1.1主要试验材料

桂皮醛（中国医药上海化学试剂公司），批号为F030516；KB细胞株、人舌鳞状细胞Tca8113细胞株、人颊黏膜鳞状细细胞癌BCaCD885细胞株（口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学）；RPMI1640培养液（Gibco公司，美国）；小牛血清（成都哈里生物公司）；噻唑蓝（methyl　thiazolylte-trazolium，MTT），每支250mg（Sigma公司，美国）；二甲基亚砜（上海药品制剂公司）；倒置相差显微镜及照相系统（Nikon公司，日本）；血细胞计数板（浙江求精医药公司）。

1.2方法

1.2.1细胞培养液的配制　取100mL小牛血清转移至约900mL　RPMI1640培养液中混匀，使其成为含10％小牛血清的培养液。按照同样的方法配制含20％小牛血清的培养液。加入碳酸氢钠溶液调节pH值为7.4。然后过滤分装至消毒好的100mL盐水瓶中，标记，-20℃保存，备用。

1.2.2桂皮醛溶液的配制　取桂皮醛原液24.4μL，加入含小牛血清的RPMI1640培养液至100mL，混匀，过滤，得到质量浓度为256mg·L-1的药物溶液。再用对倍稀释法稀释成终质量浓度为128、64、32、16、8mg·L-1的桂皮醛溶液，分装于消毒好的青霉素瓶中，-4℃保存，备用。

1.2.3MTT法检测　采用256、128、64、32、16、8mg·L-16种质量浓度的药物溶液，以24、48、72h为作用时间，用MTT法观察3种口腔鳞状细胞癌上皮细胞的生长变化，与不加药物的空白对照组比较细胞生长率的差异。1）Tca8113细胞株和KB细胞株：取对数生长期的细胞用于实验，用血细胞计数板计数，调整细胞悬液计数为每毫升3×104个，分别接种于96孔板中，每孔200μL。置于37℃、5％CO2恒温细胞培养箱内孵育，待培养细胞贴壁后，加入含不同质量浓度的桂皮醛培养液，分别继续孵育24、48、72h。每个质量浓度设6个复孔，周边空白孔加磷酸盐（phosphate　buffered　saline，PBS）缓冲液。孵育到规定时间后，轻轻取出一块96孔板，吸出培养液，弃之，PBS缓冲液轻轻洗涤，每孔加入180μL的RPMI1640培养液，再加入20μL的MTT溶液37℃、5％CO2继续培养4h后终止培养，吸出孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶充分溶解后，在酶联免疫检测仪570nm处测量各孔的吸光值。2）BCaCD885细胞株：取处于对数生长期的细胞用于实验，用血细胞计数板计数，调整细胞悬液计数为每毫升1×105个，MTT方法同前。

1.2.4细胞生长抑制率计算　细胞生长抑制率=（1-试验组平均吸光值／对照组平均吸光值）×100％。细胞生长抑制率≥30％判定为药敏试验阳性，细胞生长抑制率

1.2.5统计学处理　所有数值以均数±标准差表示，应用SPSS　16.0软件进行方差分析，以P

2　结果

2.1倒置相差显微镜下观察细胞生长情况

2.1.1KB细胞的生长情况　倒置相差显微镜观察发现，KB细胞贴壁后细胞呈多角形爬壁生长，折光性强，轮廓清楚，待细胞铺满瓶底时，呈铺路石状；细胞继续培养时，可复层生长，细胞呈圆形。加入不同质量浓度的桂皮醛后，开始细胞没有明显的变化，待药物作用24h后，部分细胞开始变圆，细胞皱缩，折光性增强，出现漂浮、不贴壁的细胞，分裂相减少。随着桂皮醛质量浓度的增加及作用时间的延长，细胞分裂相越来越少，大量细胞变圆、皱缩、漂浮，贴壁不牢固。

2.1.2Tca8113细胞的生长情况　倒置相差显微镜下观察发现，Tca8113细胞呈上皮样贴壁生长，细胞呈短梭形、多边形（类铺路石状），轮廓清楚，大小、形态较一致，细胞核类圆型、卵圆形，多居中，可见核分裂；细胞镶嵌状排列，紧密相连成单层膜状。桂皮醛组可见Tca8113细胞与桂皮醛质量浓度存在明显的量效关系，细胞呈现不同程度的形态改变，分裂相减少，细胞变圆，细胞皱缩，细胞核固缩，折光性强；有少量细胞明显变大，呈现不规则形态。随着桂皮醛质量浓度的增加，细胞分裂相更少，细胞的细胞质比例失调；大量细胞呈现不规则性，出现大量空泡，边缘呈毛刺状，出现大量悬浮、不贴壁的细胞，漂起的细胞收缩呈圆形，细胞之间失去连接，并可见较多的细胞崩解的残余。

2.1.3BCaCD885细胞的生长情况　倒置相差显微镜下观察发现，空白对照组BCaCD885细胞胞体大，境界清楚，以多边形为主，个别细胞呈蛇形或蝌蚪形，有瘤巨细胞，细胞核深染且分裂相多，细胞排列紧密时呈鳞状镶嵌状，排列有密有稀镶嵌状，有基底样细胞向棘细胞分化形态，立方形向扁平状过渡，核多居中，光密度不均匀。桂皮醛组BCaCD885细胞形态发生改变，细胞体积缩小，细胞核浓缩，偏离中央集于核膜下，核仁消失，胞膜上出现小泡但连续性完整，呈现凋亡状，出现大量不贴壁、悬浮的细胞。

2.2桂皮醛对口腔鳞状细胞癌细胞增殖的抑制

2.2.1对Tca8113细胞生长的抑制作用　同一作用时间内，随着桂皮醛质量浓度的增加，Tca8113细胞的增殖抑制率明显增大。其中，以256mg·L-1组对细胞增殖抑制率最高，可以达到92.24％。同一作用剂量组内，随着作用时间延长，细胞增殖抑制率有所增加，但各组间差异无统计学意义（P>0.05）。在各个不同作用质量浓度桂皮醛组内，表现为随着作用时间的延长，细胞增殖抑制率有一定程度的增加，在各个作用时间段内，随着桂皮醛质量浓度的增高，细胞生长增殖抑制率出现时间效应关系，但是未见细胞生长变化率随着作用时间延长出现明显的下降趋势（P>0.05）（图1）。

2.2.2对KB细胞株生长的抑制作用　同一作用时间内，随着药物质量浓度的增加，KB细胞增殖抑制率明显增大。药物质量浓度为256mg·L-1时对细胞增殖抑制率达到93.13％。同一作用剂量组内，随着作用时间延长，细胞增殖抑制率有所增加（图2），但是各不同作用时间组的细胞变化生长率结果差异无统计学意义（P>0.05）。在各不同桂皮醛质量浓度组内，随作用时间的延长，细胞增殖抑制率有一定的程度的增加，各作用时间段内，随桂皮醛质量浓度增高，细胞生长增殖抑制率出现时间一效应关系，但未见细胞生长变化率随着作用时间延长出现明显的下降趋势（P>0.05）。

2.2.3对BCaCD885细胞生长的抑制作用　同一作用时间内，随着桂皮醛质量浓度的增加，BCa-CD885细胞增殖抑制率明显增大，以256mg·L-1组对细胞增殖抑制率最高，可以达到91.49％。同一作用剂量组内，虽然随着作用时间延长，桂皮醛对细胞增殖抑制率有所增加（图3），但是各不同作用时间组的细胞变化生长率结果差异无统计学意义（P>0.05）。

3　讨论

研究发现，桂皮醛在体外对多种肿瘤细胞具有杀伤、抑制和直接细胞毒作用，并且能够诱导肿瘤细胞发生凋亡。桂皮醛对体外培养的多种肿瘤细胞，如人皮肤黑色素瘤A375细胞、肝细胞瘤HCC-9727细胞、肾癌GRC-1细胞、乳腺癌SKBr-2HL细胞、宫颈癌Hela细胞、胃癌SGC-7901细胞、食道癌Eca-109细胞等均具有不同程度的增殖抑制作用。有学者报道在Fischer’s培养基中，桂皮醛对小鼠白血病L1210细胞的抑制率可达到50％，还发现其抑制作用可能与桂皮醛分子终端的醛基有关，其醛基团能够通过捕获细胞分子中的巯基所包含的氨基酸来阻滞肿瘤细胞蛋白质的合成，从而进一步抑制小鼠白血病L1210细胞的生长。Kwon等也曾报道就抗肿瘤活性方面而言，丙烯醛基是桂皮醛相关化合物的关键功能基团。Imai等报道在转基因以及非转基因小鼠中桂皮醛能够抑制4-甲基亚硝胺-1-（3-吡啶基）-1-丁酮诱导的肺部肿瘤的发生。Wu等发现，桂皮醛通过Bcl-2蛋白家族的促凋亡活性和激活促分裂素原活化蛋白激酶信号通路诱导人肝癌细胞PLC／PRF／5的凋亡。肉桂醛通过活性氧介导的线粒体通透性转换以及由此产生的细胞色素C的释放诱导人早幼粒白血病HL-60细胞凋亡。目前，有关桂皮醛在口腔鳞状细胞癌细胞抑制作用方面的研究尚缺乏报道。本研究选用3种常见的口腔鳞状细胞癌细胞株为研究对象，应用质量浓度为256、128、64、32、16、8mg·L-1的桂皮醛溶液在不同作用时间下对常见口腔鳞状细胞癌细胞增殖的影响，从而评估桂皮醛的抗口腔肿瘤细胞活性。

本研究选用MTT法测定桂皮醛对3组常见的口腔鳞状细胞癌细胞株生长增殖的影响，通过酶标仪测量其吸光度值，从而推算肿瘤细胞在药物中的存活率，细胞存活率越低，表明药物对细胞的杀伤力越强，即敏感性越高。该方法因具有简便、快速、客观、经济、灵敏性高、所需细胞数量少、人为误差较小且没有放射性污染，实验结果与临床疗效之间吻合性良好等优点而被广泛应用于体外抗癌药物的敏感性检测。据报道此法早于1991年被美国国立癌症研究所纳入了抗癌药物的筛选程序。Sargent通过多年对MTT方法的研究应用认为，MTT法的检测结果与化疗敏感性和耐药性方面有显著的一致性，能够为临床上个体化选择化疗方案提供相对准确的参考依据。

本研究采用MTT法观察了不同质量浓度的桂皮醛对Tca8113细胞、BCaCD885细胞和KB细胞增殖的影响。结果表明与对照组相比，桂皮醛对此3株人口腔鳞状细胞癌细胞株均具有明显的增殖抑制活性，细胞存活率随着药物作用剂量的增加而降低，表现出一定的剂量-效应依赖性，且桂皮醛诱导的Tca8113细胞、BCaCD885细胞抑制作用在8mg·L-1质量浓度时；KB细胞抑制作用在16mg·L-1质量浓度时有显著性意义。桂皮醛作用24h时，作用质量浓度为16mg·L-1时，对Tca8113细胞抑瘤率达到58.33％；作用质量浓度为32mg·L-1时对KB细胞株及BCaCD885细胞株的抑瘤率分别为66.08％、76.61％，鉴于中国抗癌药物筛选疗效评价标准中规定药物抑瘤率为30％以上认为有意义，因而关于桂皮醛的抗肿瘤作用是肯定的。培养细胞的倒置相差显微镜观察结果也直观的反应了药物对肿瘤细胞增殖抑制作用。