PDCD5与BCL-2在多发性骨髓瘤中的表达

【摘要】目的：研究促凋亡基因PDCD5和抑凋亡基因BCL-2在多发性骨髓瘤中的表达情况。方法：免疫组化及逆转录-聚合酶链反应方法（RT-PCR）检测31例及25例正常对照骨髓单个核细胞中PDCD5和BCL-2蛋白及mRNA的表达，用统计软件分析其表达水平之间的关系。结果：MM组PDCD5阳性细胞率（%）和染色强度指数（SII）均显著低于对照组，BCL-2阳性细胞率（%）和SII显著高于对照组，PDCD5蛋白和BCL-2蛋白阳性细胞率（%）呈负相关（r=-0.86，P

【关键词】PDCD5；BCL-2；多发性骨髓瘤

文章编号：1009-5519（2007）21-3184-04 中图分类号：R36 文献标识码：A

多发性骨髓瘤（MM）是浆细胞克隆性增生的恶性肿瘤,是一种低增殖性、低凋亡活性的分子克隆疾病，这一特点提示凋亡抑制可能在其发病中发挥了关键的作用。BCL-2是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因，已经证实BCL-2为代表的凋亡抑制基因表达的上调和MM细胞寿命及化学药物抗性有关[1，2]。PDCD5是近年发现的凋亡相关新基因，实验表明PDCD5是促凋亡基因，有可能为一种新的早期凋亡的标志。本实验研究该基因在MM中的表达情况及其与BCL-2表达之间的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象：所有MM的骨髓均取自湘雅三医院2006年3月～2007年3月门诊及住院病人，共31例，其中男20例，女11例，年龄54～75岁，平均62岁，31例均为多次化疗后未缓解的病人。根据Bataille分期标准，Ⅰ期9例，Ⅱ期13例，Ⅲ期9例。另有非恶性血液病对照组25例，其中男17例，女8例，年龄49～73岁，平均58岁，所有入选对象均排除自身免疫性疾病、恶性肿瘤等可能影响PDCD5和BCL-2表达的疾病。

1.2 实验方法：（1）骨髓单个核细胞分离：按照淋巴细胞分离液说明书分离骨髓单个核细胞，显微镜下计数，调整细胞浓度至3～6×109/L，备用。（2）免疫组织化学染色：细胞悬液滴片，4%多聚甲醛-PBS液室温下固定30分钟，PBS液洗涤5分钟×3次，按照SP-9000试剂盒介绍方法进行实验，以0.01×PBS液代替一抗作为空白对照。结果判断：PDCD5及BCL-2 阳性染色均为胞浆内棕黄色颗粒。每张滴片观察500个细胞，分别计数PDCD5及BCL-2染色阳性的细胞，染色强度分为4级，即阴性、弱阳性、阳性及强阳性，分别记0、1、2、3分，计算阳性细胞百分比，并以每一强度的细胞数目计算细胞染色强度指数（staining intensity index,SII）SII=[3](阴性细胞数×0)+(弱阳性细胞数×1)+(阳性细胞数×2)+(强阳性细胞数×3)。（4）RT-PCR法：选择β-actin基因为内参，PRIMER5软件设计BCL-2及PDCD5、β-actin引物，由上海生物工程技术有限公司合成。引物序列如下：（1）Bc1-2：上游引物：5’-ACACTGTTAAGCATGTGCCG -3’；下游引物：5’-CCAGCTCATCTCACCTCACA-3’ 318bps。（2）PDCD5：上游引物：5’-CGGA-

ATTCACCATGGCGGACGAGGAGC-3’；下游引物：5’-CGGA-

ATTCAATAATCGTCATCTTCATC-3’ 395bps。（3）β-actin上游引物：5’-ctccatcctggcctcgctgt-3’；下游引物：5’-gctgtcaccttcaccg-

ttcc-3’ 268bps。

总RNA的提取、cDNA的合成、PCR扩增步骤参照试剂盒说明书。PCR产物分析： 1.5%琼脂糖凝胶电泳在85V电压下电泳60分钟，SYNGENE凝胶图像处理系统扫描并读取灰度值，以PDCD5、BCL-2与β-actin灰度值的比值作为PDCD5、BCL-2 mRNA的相对表达水平，各标本重复2次，取平均值。

1.3 统计学处理：结果用均数±标准差(x±s)表示，两样本均数的比较采用t检验， PDCD5和BCL-2的阳性细胞率和mRNA相对表达水平的相关性用Pearson直线相关检验，P

2 结果

2.1 MM与对照组PDCD5、BCL-2蛋白的表达

2.1.1 MM组与对照组PDCD5蛋白的表达：MM组阳性细胞率和SII明显低于对照组（P

2.2 MM组与对照组PDCD5、BCL-2 mRNA的表达：（1）MM组与对照组PDCD5mRNA的表达：MM组及非恶性血液疾病对照组骨髓单个核细胞PDCD5 mRNA与β-actin的比值分别为0.33±0.07、0.53±0.05，MM组PDCD5 mRNA的相对表达水平明显低于对照组，其差异有统计学意义（P

3 讨论

细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，具有重要的生物学意义和复杂的分子生物学机制。目前认为，细胞凋亡的过程实际上是被死亡受体（Death Recepter，DR）和线粒体两种主要途径激活后，caspases（半胱氨酰-天冬氨酸蛋白酶）不可逆有限水解底物的级联放大反应过程，caspases家族分子层叠活化，向下游传递凋亡信号的同时水解多种细胞内蛋白，包括结构蛋白、信号转导分子和caspases自身，导致DNA降解，染色质浓缩，形成细胞凋亡的特征性变化[4]。

PDCD5是近年新发现的凋亡相关基因之一，实验证明PDCD5经过真核表达载体导入或大肠杆菌表达重组蛋白导入多种细胞后，单独不能对细胞产生明显的影响，但加入诱导凋亡的因素即可明显促进细胞凋亡，这些结果表明PDCD5是凋亡促进剂而非凋亡诱导剂［5～7］。PDCD5能与caspase 3的活化大片段特异性结合,是caspase 3入细胞核发挥活性的正向调节分子,其在细胞凋亡的早期高表达并能快速核转位,能有效促进细胞凋亡和抑制细胞生长[8]。田辉凯等[9]研究证明, 重组PDCD5蛋白使分离的小鼠肝线粒体膜通透性转运孔开放, 线粒体跨膜电位下降, 细胞色素C等凋亡因子释放，从而形成正回馈放大环路, 促进细胞凋亡的发生、发展。

BCL-2是最重要的抗凋亡基因之一，研究表明BCL-2的过度表达参与了包括多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病等在内的多种血液系统恶性肿瘤的发病机制[10]。过表达的BCL-2能抑制内膜超极化和线粒体肿胀，保持外膜完整，抑制cytc 的释放，使cytc 无法达到激活半胱氨酸蛋白酶的阈值，也能抑制不依赖cytc 的半胱氨酸蛋白酶如Caspase-8 和下游的Caspase-2、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7 的正反馈放大作用[11]，能调控附着在线粒体膜上的半胱氨酸蛋白酶，使其酶活性与在细胞质时大不相同，能抑制Caspase-9的活化以及其对Caspase-3的激活，还可以作用于线粒体通透性转变孔(permeability transition pore，PT孔)的有关蛋白，阻止PT 孔的开放，维持跨膜电位，从而抑制凋亡的诱导，总之，BCL-2基因过度表达可以促进细胞的生存。

细胞凋亡是一个复杂的基因调节过程，凋亡的促进因子和抑制因子相互作用以维持平衡，细胞是否进入凋亡程序取决于促进因子和抑制因子相互作用的最终结果。PDCD5在成熟组织细胞的增殖分化和内稳定中可能发挥重要的负调节作用，能抑制某些肿瘤的生长,加速凋亡的发生[12]，BCL-2在抑制细胞凋亡的同时并不促进细胞增殖[13]。本实验中，多发性骨髓瘤组PDCD5蛋白及mRNAPDCD5表达下调而BCL-2蛋白及mRNA表达上调，前者表达下调和后者上调的共同效应均是引起阻止细胞凋亡的同时不促进细胞增殖，这与多发性骨髓瘤低增殖活性、低凋亡活性的生理病理特点完全相符，因此推测促凋亡基因PDCD5表达减少以及抑凋亡基因BCL-2表达增高引起浆细胞正常凋亡受阻，一方面使突变细胞异常生长,另一方面通过延长骨髓干细胞的生存期使其经受一些致癌因素作用的机会和危险增加，这可能是多发性骨髓瘤的发病过程中的一个重要因素。至于PDCD5和BCL-2在恶性浆细胞凋亡通路中的定位、二者相互作用的位点以及其他凋亡相关因子与他们二者之间的相互关系仍需进一步深入的研究。

参考文献：

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收稿日期：2007-07-09