OX40 OX40L共刺激分子在肝移植急性排斥反应中作用的实验研究

作者：胡曼丽 范恩学 孙海侠 王焕丽

【摘要】 目的 探讨共刺激分子途径在免疫耐受的作用机制。方法 制作大鼠肝移植模型，应用抗cd134抗体+雷帕霉素联合药物抑制急性排斥反应的发生。结果 空白对照组：sd对wistar组存活时间因有排斥反应致存活时间短；移植治疗对照组：单纯抗cd134组与单纯雷帕霉素组，其中sd对sd组和wistar组对wistar组大鼠间肝移植因未见明显的排斥反应，存活时间长，mhc完全不匹配的sd对wistar组存活时间短，前两者（sd对sd组和wistar组对wistar组）和后者（sd对wistar组）间抑制排斥反应有统计学差异；抗cd134抗体与雷帕霉素联合治疗组：sd对sd组，wistar组对wistar组因未见明显的排斥反应及封闭了共刺激途径，存活时间一样长，前两者（sd对sd组、wistar组对wistar组）和后者（sd对wistar组）间抑制排斥反应有统计学差异，结果显示抗cd134抗体与雷帕霉素联合治疗组抑制移植效果最佳。结论 应用抗cd134抗体+雷帕霉素可以诱导免疫耐受的产生。

【关键词】 共刺激分子 肝移植急性排斥反应 抗cd134抗体 免疫耐受

研究免疫耐受诱导的方案很多，由于是单一途径刺激，效果不好。 许多学者开始提出多途径协同刺激方案。抗cd134基因工程抗体可用来封闭ox40-ox40l共刺激相关分子,影响细胞活化，诱导免疫耐受的产生。

1 材料与方法

1.1 抗体来源 我们从美国sigma公司引进抗cd134基因工程抗体1000mg/ml和抗大鼠il-a、tnf、ifn抗体。

1.2 实验分组 选取mhc（组织相容复合体）完全不匹配的雄性sd大鼠（供体）、8-10周龄、体重200-240g。雄性wistar大鼠（供体）、8-12周龄、体重200-240g。由吉林大学实验动物（清洁级动物）提供，随机分成10组，每组8只，供肝脏移植用。10组分别于3天、6天、9天、12天、16天、20天给药：对照组腹腔注射生理盐水；2、3、4组注射抗大鼠cd134抗体0.5mg/只；5、6、7组肌肉注射雷帕霉素1mg/kg/d/只；8、9、10组给雷帕霉素1mg/kg/d/只和抗大鼠cd134抗体0.5mg/只。

1.3 大鼠肝脏移植术式 采用腹腔原位肝脏移植法。大鼠麻醉采用30mg/kg戊巴比妥腹腔注射。麻醉生效后，分别切除受体肝脏，用7-0 proleme-连续端端吻合肝脏上下腔静脉（ivc），用套管法吻合门静脉（pv），胆管重建采用stent端端吻合法。移植肝脏冷血时间为30min之内。移植手术是否成功判断标准为术后关腹前观察移植肝脏血运情况。完全血运且无渗血为移植模型成功。

1.4 he染色及免疫组化染色

1.4.1 he染色方法 切取移植的肝脏组织，石腊切片脱蜡和水化后蒸气水洗；哈瑞氏苏木精浅染核5分钟；自来水冲洗；1%盐酸酒精分化—自来水冲洗；0.1%弱氨水返蓝—自来水充分冲洗—蒸气水洗；伊红染,15分钟；常规脱水,透明,封片。常规切片，he染色镜下观察。

1.4.2 免疫组化制备（sabc法） 实验抗大鼠il-a、tnf、ifn抗体按说明书进行。一抗的工作稀释度均为1∶400，为阴性对照。将目镜配上10×10计数格，在高倍镜下随机选择4个视野，计数4个视野的平均阳性细胞数。细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性，分别表示如下：棕黄色-+++，黄色-++，淡黄色-+，无色为阴性,表示计量分析将组化片扫描图像输入计算机，采用计算机图像分析软件计数浸润的炎症细胞数量。

2 结果

2.1 抗大鼠il-a，tnf、ifn抗体免疫组化细胞浆内出现棕黄色颗粒情况，分别表示如下：空白对照组未出现；抗cd134抗体治疗组和雷帕霉素治疗组各出现较少，经t检验，抗cd134抗体治疗组和雷帕霉素治疗组两组间无统计学差异；抗cd134抗体治疗组和雷帕霉素联合组最多，分别和抗cd134抗体治疗组、雷帕霉素治疗组有统计学意义。其中以sd对wistar组最为明显。说明联合组抑制共同刺激途径效果最好。

2.2 各组肝移植后大鼠存活时间（天） 空白对照组：sd对wistar组存活时间因有排斥反应致存活时间短；移植治疗对照组：单纯抗cd134组与单纯雷帕霉素组其中sd对sd组和wistar组对wistar组大鼠间肝移植因未见明显的排斥反应，存活时间长， mhc完全不匹配的sd对wistar组存活时间短，前两者（sd对sd组和wistar组对wistar组）和后者（sd对wistar组）间抑制排斥反应有统计学差异。抗cd134抗体与雷帕霉素联合治疗组，sd对sd组，wistar组对wistar组因未见明显的排斥反应及封闭了共刺激途径，存活时间一样长，前两者（sd对sd组、wistar组对wistar组）和后者（sd对wistar组）间抑制排斥反应有统计学差异，结果显示：抗cd134抗体与雷帕霉素联合治疗组抑制移植效果最佳，除此之外有两只同系移植大鼠存活120天。由此证明，cd134组与雷帕霉素联合组在移植免疫排斥抑制效果最佳，因此移植与配型、受、供之间配型接近者效果好。

3 讨论

本研究建立肝移植动物模型，分10组，分别给生理盐水对照、抗cd134抗体治疗组、雷帕霉素治疗组及抗cd134抗体+雷帕霉素治疗组，研究对于肝移植免疫耐受的效果，移植结果表明：cd134组与单纯雷帕霉素联合用移植免疫排斥抑制效果最佳，因此移植与配型、受、供之间配型接近者效果好。

新的共刺激分子的认识和定性导致了移植免疫领域的研究者再次改写了t细胞激活的双信号模式。t细胞的完全激活在机理上更为复杂，可能需要几种共刺激信号途径的相互作用。这些信号（正性或负性）及其表达的方式（空间或时间）各不相同，反映出它们在介导t细胞应答中的不同作用。尽管各条共刺激信号途径的相互作用存在其自身复杂性，正如ctla4-ig在ii期临床研究中的成功表现，选择性单个分子的阻断仍然是建立免疫耐受有效的策略之一。抗cd134共刺激通路在大鼠肝移植免疫排斥反应中起重要作用，但由于种属不同其作用也有明显差异，cd134在大鼠和人的淋巴细胞中不表达，而cd8淋巴细胞在急性排斥反应中起关键作用，因此，利用大鼠动物模型研究cd134共刺激通路的作用机制对于人类移植排斥反应的预防有重要的指导意义。但是不同种属之间引起排斥反应的强度和机制不同，但通过免疫抑制的治疗可明显延长肝移植大鼠的存活时间。本研究采用排斥反应最强的sd大鼠与wistar大鼠间肝脏移植更有利于抗排斥反应的治疗和方法研究。免疫病理研究结果显示，炎症细胞浸润是出现移植物排斥反应的重要标志，抑制炎症细胞浸润可以明显降低排斥反应的发生。本研究结果显示，单独应用抗cd134刺激通路阻断均不能明显抑制炎症细胞的浸润，而雷帕霉素与抗cd134联合应用可明显降低总细胞浸润的数量，但巨噬细胞下降不明显。总之，炎症细胞浸润结果与大鼠肝移植存活时间结果相一致。证明移植排斥反应机制是复杂的，是由多个通路参与排斥反应调节，只有多通路的联合抑制才能达到理想的治疗效果。

参 考 文 献

[1]张中夫，韩德五，张芸等.高迁移率组蛋白-1在实验性急性肝衰竭中的作用[j].中华肝胆病杂志，2006，14(5）:393-394.

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