胆木叶和胆木的相似性研究

[摘要]建立HPLC定量指纹图谱检测方法，对3批胆木叶和胆木进行测定，比较其异长春花苷内酰胺的含量和指纹图谱的差异，并采用LC-MS对指纹图谱色谱峰进行指认，获得胆木叶和胆木化学成分差异信息。胆木中的异长春花苷内酰胺的含量高于胆木叶；胆木叶和胆木指纹图谱色谱峰有差别，胆木叶的化学成分较胆木丰富；LC-MS检测结果表明胆木叶和胆木中主要化学成分为生物碱，胆木叶和胆木有7种相同的化学成分。胆木叶和胆木的相似性研究为开发胆木叶潜在药用价值和胆木资源的可持续利用提供一定的科学依据。

[关键词]胆木叶；胆木；指纹图谱；LC-MS

胆木，又名药乌檀、乌檀、黄羊木，为茜草科乌檀属乔木乌檀NaucleaofficinalisPierreexPitard[1]，以枝、干、皮入药，性味苦、寒，具有清热解毒、消肿止痛作用，可用于多种感染和炎症。化学成分主要有生物碱、酚类和三萜类，异长春花苷内酰胺（strictosamide）是其主要有效成分[1]。目前市售的有“胆木注射液”和“胆木浸膏片”中药制剂。胆木主要分布于广东、广西和海南等地，近年来随着资源不断的采收，导致胆木药材急缺，被国家林业部列为重点保护的珍稀野生物种之一。

乌檀有大量的叶子，俗称胆木叶，近年来对胆木叶的化学成分和药效研究越来越多，文献报道胆木叶中也含有丰富的生物碱[3-5]，胆木叶提取部位群ELN（主要指标性成分异长春花苷内酰胺的质量分数16%左右）具有显著的镇痛和抗炎的作用[2]，提示胆木叶具有潜在的药用价值。但是对胆木叶和胆木相似性研究报道较少。本文拟采用HPLC测定3批胆木叶和胆木中异长春花苷内酰胺的含量；建立HPLC指纹图谱检测方法对3批胆木叶和胆木进行检测，比较其指纹图谱的差异，并采用LC-MS对指纹图谱色谱峰进行指认，获得胆木叶和胆木化学成分差异信息，从整体和部分化学成分的角度分析，阐明胆木叶和胆木的异同，为挖掘胆木新的药用部位，扩大药源，可持续开发提供科学依据。

1材料

安捷伦1100高效液相色谱仪；安捷伦1290高效液相色谱仪；安捷伦6538Q-TOF/MS检测器；梅特勒AE240电子分析天平；密理博纯水仪；数显恒温水浴锅；艾本德5424高速离心机。

乙醇（分析纯，南京化学试剂有限公司，批号14051211063）；甲酸（HPLC级，批号2B3026，美国罗伊科技股份有限公司）；磷酸（分析纯，南京化学试剂有限公司，批号13072211046）；乙腈（色谱纯，天地公司，1205080）；Milli-Q超纯水（自制）。异长春花苷内酰胺（中国食品药品检定研究院，批号100080-200707）；

胆木叶和胆木均由江苏康缘药业股份有限公司提供（产自海南省，由南京中医药大学吴德康教授鉴定，采收时间为2014年9月）；胆木叶批号20131013，20131129，20140115；胆木批号20140125，20140227，20140318。

2方法

2.1胆木叶和胆木中异长春花苷内酰胺的含量测定

2.1.1色谱条件色谱柱汉邦LichrospherC18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脱程序见表1；流速1mL・min-1；检测波长226nm；柱温30℃。

2.1.2对照品溶液的制备精密称取异长春花苷内酰胺对照品适量，加乙醇制成每1mL含0.1mg的溶液，即得。

2.1.3供试品溶液的制备取本品粉末（过3号筛）1g，精密称定，置250mL圆底烧瓶中，精密加入70%乙醇100mL，称定质量，加热回流2h，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，计算异长春花苷内酰胺的含量。

2.2胆木叶和胆木指纹图谱比较

色谱条件，对照品溶液的制备，供试品溶液的制备，测定法（同2.1项下条件）。

2.3胆木叶和胆木LC-MS检测

2.3.1供试品溶液的制备使用2.1.3制备的胆木叶（批号20131013）和胆木（批号20140125）的供试品溶液。

2.3.2色谱条件色谱柱AgilentExtendC18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）见表2；流速1mL・min-1；检测波长203，226，254，360，365nm；柱温30℃。

2.3.3质谱条件质谱检测条件为干燥氮气流速10.0L・min-1；干燥气体温度350℃；雾化压力50psi（1psi=6.895kPa）；毛细管电压POS-4000V和NEG-3500V；Fragmentor（毛细管出口电压）135V；Skimmer电压65V；离子扫描范围m/z100～3000。数据采集及处理分别采用安捷伦质谱采集B.03.01（安捷伦科技）及安捷伦质谱工作站B.03.01（安捷伦科技）分析软件。

2.3.4测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定。

3结果与讨论

3.1胆木叶和胆木异长春花苷内酰胺的含量测定

3.1.1线性关系考察分别精密吸取对照品储备液（质量浓度为0.975g・L-1）0.1，0.5，1，2，4，6mL，置6个10mL量瓶中，分别加乙醇至刻度，摇匀，即得。分别精密吸取上述6种溶液10μL，进样，测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

3.1.2精密度考察取对照品溶液连续进样6次，记录异长春花苷内酰胺的峰面积，计算RSD。

3.1.3稳定性考察取供试品溶液分别于0，2，4，8，12，24h进样测定，记录异长春花苷内酰胺的峰面积，计算RSD。

3.1.4重复性考察取同一批胆木叶药材，精密称定，平行6份，按2.1.3制备供试品溶液，进样测定，计算含量和RSD。

3.1.5加样回收率实验取已知含量的同一批胆木叶药材，平行6份，每份0.5g，分别精密加入一定量的异长春花苷内酰胺对照品溶液，按2.1.3制备供试品溶液，进样测定，计算回收率和RSD。

结果显示异长春花苷内酰胺在0.0975～5.85μg呈良好线性关系，回归方程为Y=37745X+73.54，r=0.9999；回收率在96.45%～100.6%；RSD均在3%以内，表明精密度、重复性、回收率、24h内稳定性均良好，方法稳定可靠。

3.1.6样品测定3批胆木叶和3批胆木中异长春花苷内酰胺的含量测定，见表3，显示胆木中的异长春花苷内酰胺含量比胆木叶高。

3.2胆木叶和胆木HPLC指纹图谱的对比

3.2.1精密度考察取供试品溶液，连续进样6次，考察精密度。

3.2.2稳定性考察取供试品溶液分别于0，2，4，8，12，24h进样测定，考察稳定性。

3.2.3重复性考察取同一批胆木叶药材，精密称定，平行6份，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，进样测定，考察重复性。

以异长春花苷内酰胺峰为对照峰，选取峰面积百分含量大于1%的10个共有峰计算相对保留时间的RSD（%）和相对峰面积的RSD（%），并计算相似度。

结果显示RSD均在3%以内，相似度大于0.99，表明精密度、重复性、24h内稳定性均良好，方法稳定可靠，符合指纹图谱技术要求。

3.2.4指纹图谱叠加对比将测定的3批胆木和胆木叶HPLC指纹图谱进行叠加对比，发现不同批次胆木或胆木叶之间指纹图谱峰差异不大，但胆木叶和胆木的指纹图谱有差异，见图1。

3.3胆木叶和胆木指纹图谱化学成分指认

为了指认指纹图谱中的色谱峰，阐明胆木叶和胆木的化学成分异同，将指纹图谱色谱条件转移至LC-MS进行分析测定，其中异长春花苷内酰胺和芦丁采用对照品比对，其他成分均是参考文献检索[6-21]和相对分子质量，推测鉴定成分，见图2，3，表4，5。

些，见图4。胆木叶和胆木相同成分有7种，推测结果见表6。胆木叶中鉴别出10种不同于胆木的成分，胆木中鉴别出7种不同于胆木叶的成分，推测结果见表7。

4结论

胆木中异长春花苷内酰胺的含量高于胆木叶，不同批次的胆木叶或胆木之间HPLC指纹图谱较为相似，但胆木叶和胆木的HPLC指纹图谱有差异，胆木叶的成分相对于胆木要丰富一些。将指纹图谱的条件转移至LC-MS中进行胆木叶和胆木的色谱峰指认，采用对照品比对，综合文献检索和相对分子质量，从胆木叶中推测鉴别出17种化学成分，从胆木

中推测鉴别出14种化学成分，其中胆木叶和胆木相同的化学成分有7种。LC-MS检测结果表明胆木叶和胆木中主要化学成分为生物碱。胆木叶的来源相对于胆木药材具有显著的优势，无需砍伐胆木树作为代价就能提供药材来源，并且胆木叶具有再生的优势，本研究为胆木资源的可持续开发利用提供了

研究思路。由于没有进行深入的药效学研究，对能否完全替代本研究现在不作论断，有待于后续对其药效进行研究，这也是本研究的不足之处。

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