黄绿青霉素对心脏毒性损伤作用

作者：刘密凤，王丽华，林林，姚洪菊，张芳鸣，王，杨建伯

【摘要】 目的 观察黄绿青霉素(CIT)对离体心肌细胞及大鼠心肌组织结构和功能的损伤。方法 电镜检查法观察黄绿青霉素致离体心肌细胞超微结构的改变，并对15mg／(kg·d)CIT喂饲8周的大鼠心肌组织进行病理学观察。结果 光镜下CIT处理组大鼠心肌发生变性和坏死，病变呈灶状或条索状分布，有炎性细胞浸润，肌原纤维凝集崩解，部分心肌细胞颗粒变或空泡变性。电镜下，2?5μmol/L CIT组，细胞形状不规则，染色质边集，肌丝明显，胞质内存在脂滴颗粒，线粒体嵴清晰，部分线粒体空泡变性；25μmol/L CIT可使完整的肌细胞结构消失；随剂量增加，毒性作用增强。结论 CIT在体内和体外均可引发心肌的变性和坏死。

【关键词】 黄绿青霉素

黄绿青霉素(CIT)是黄绿青霉的次级毒性代谢物，能在较低的温度和较高的湿度下生长〔1〕，自然界中广泛存在，容易污染新收获的农作物，呈黄绿色霉变，食用后可发生急性中毒，是一种与人类生活密切相关的真菌毒素。现已证明，该毒素具有神经毒作用〔2〕及致畸性〔3〕。也有研究认为，其可能是克山病的病因〔4〕。该毒素在体外能抑制人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）活性及白色念球菌生长〔5〕。本文旨在从体内和体外水平观察黄绿青霉素的心脏毒性作用。

1 材料与方法

1?1 仪器和试剂 Olympus光学显微镜和倒置显微镜：CO2恒温培养箱；超速低温离心机；净化工作台；Millipore超纯水系统；spc-10Avp液相色谱仪(日本岛津公司)；Uv-VIS检测器；数据采集和处理使用的色谱工作站；凯氏振荡器；手术器械及细胞培养瓶等。黄暗青霉菌(Penicillium citreonigrum Dierckx,PCV)(中科院微生物研究所)；CIT标准品和胶原酶Ⅱ(美国Sigma公司)；最低必需培养基(MEM)和胎牛血清(美国GIBCO公司)；胰蛋白酶(美国AMRESCO公司)；其余试剂均为国产分析纯。

1?2 实验动物 雌性Wistar大鼠，体重80～120g(哈尔滨市兽医研究所)；观察和检疫1周。出生1～3d Wistar乳鼠(哈尔滨医科大学附属第一医院实验动物中心)。

1?3 心肌细胞原代培养 新生Wistar乳鼠，无菌取心肌，清洗并剪碎，0?1％胰蛋白酶消化5min后弃去，加入10ml 1mg／ml的胶原酶Ⅱ，37℃下消化30～40min，500r／min离心5min，含20％胎牛血清的基础培养液制成细胞悬液，37℃，5％CO2温箱内培养。根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同，采用差速贴壁分离法，并在前3d的培养液中加入0?1mmol/L 5-溴脱氧核苷酸，以抑制成纤维细胞的增殖。

1?4 黄绿青霉素致离体心肌细胞损伤的电镜观察 CIT连续倍比稀释成25，2?5μmol/L剂量组，按常量分别加入已基本长成单层的心肌细胞中，同时设立正常细胞对照组。24h后将细胞刮下，2?5％戊二醛固定，常规电镜检查。

1?5 黄绿青霉素致大鼠心肌组织的毒性观察 黄绿青霉素的生物合成〔1〕，并利用高效液相色谱法进行检测〔6〕。Wistar大鼠随机分为2组，每组7只，分笼喂养。A组作为正常对照组，饲以普通饲料；B组给予15mg／(kg·d)CIT，并随体重增加而增加。8周后处死动物，剪取心肌组织，10％甲醛固定，常规病理学检测。

2 结果

2?1 CIT对心肌细胞超微结构的影响 培养的心肌细胞，体积较大，表面光滑，胞质内有肌丝散在分布，Z线清晰，质膜下游离白体丰富，线粒体发达，嵴明显可见。2?5μmol/L剂量组，肌细胞为不规则形，细胞核内高密度的染色质边集核膜下，核周Z线结构清晰，肌丝明显，胞质内存在脂滴颗粒，线粒体嵴清晰，相邻细胞以脂膜紧贴，未见连接结构，部分线粒体出现空泡变性。25μmol/L剂量组，未见完整的肌细胞结构，疑为肌细胞的胞质内有大量的脂滴颗粒存在，细胞功能状态不佳，其他肌细胞轮廓不清，胞质内线粒体高密度团块状，嵴微细结构不明显，见图1～3。

图1 电镜下正常培养心肌细胞（略）

图2 电镜下2?5μmol/L CIT处理的心肌细胞（略）

图3 电镜下25μmol/L CIT处理的心肌细胞（略）

2?2 黄绿青霉素对实验动物体重及脏体比值的影响 实验开始时，实验组与对照组体重比较，差异无统计学意义(P＞0?05)。给予CIT后，实验组体重无明显增加，对照组体重增长明显(P<0?01)。实验组大鼠的心、肝、肾脏与体重的比值均高于对照组，差异有统计学意义(P<0?01)。

2?3 黄绿青霉素对大鼠心肌组织结构的影响 光镜下，对照组心肌纤维排列规整，无明显异常。实验组大鼠心室肌均出现明显病变，病变呈灶状或条索状分布，涉及范围较大，有大量淋巴细胞和单核细胞浸润，间质水肿，心肌细胞呈颗粒变性，肌浆凝聚，肌原纤维凝集、崩解，部分心肌细胞空泡变性，见图4，5。

图4 CIT处理组心室肌病变(HE染色，×40)（略）

图5 CIT处理组心室肌(HE染色，×200)（略）

3 讨论

黄绿青霉素是黄绿青霉、黄暗青霉、瘿青霉、垫状青霉、毒青霉等青霉菌的次级毒性代谢物，由α-吡喃酮色基、多烯部分和氢呋喃环3部分组成〔1〕，其中吡喃酮-多烯结构中的共轭多烯系统是与三磷酸腺苷酶（ATP）结合的重要组分，可与线粒体ATP酶β亚基相结合，使其活性受抑，己证实CIT是线粒体可溶性ATP酶的强效抑制剂，可抑制牛心肌和大鼠肝脏线粒体中，ADP刺激的呼吸作用；ATP驱动的氧化辅酶Ⅰ还原琥珀酸盐；及牛心肌线粒体亚单位中，ATP驱动的辅酶Ⅰ转氢酶和ATP酶活性〔7〕。CIT可能通过对线粒体的损伤而对多器官、多系统产生毒性作用，其主要靶器官为呼吸系统和循环系统，可引起实验动物鼠、猫、狗、和蛙等进行性麻痹，全身僵直，低温，呼吸困难，直至死亡。本研究显示，CIT可致大鼠心肌发生变性和坏死，呈灶状散在分布，涉及面较大，有炎性细胞浸润，心肌细胞呈空泡样变，间质水肿，横纹消失。应属于吞噬阶段的较早病变，与本实验的急性期特点相符合，表明病变尚处于发展中。

【参考文献】

〔1〕 Ueno Y.Citreviridin from penicillium citreo-viride Biourge,Mycotoxins［M］.Amsterdam Oxford New York: Elsevier Scientific Publishing Company,1974:291-300.

〔2〕 Ueno Y,Ueno I.Isolation and acute toxicity of citreoviridin,a neurotoxic mycotoxin of penicillium citreo-viride Biourge［J］.Japan J Exp Med,1972,42 (2): 91-105.

〔3〕 Morrissey RE,Vesonder RF.Teratogenic potential of the mycotoxin,citreoviridin,in rats［J］.Food Chem Toxicol,1986,24 (12): 1315-1320.

〔4〕 杨建伯，杨秋慧.克山病病因研究［J］.中国地方病学杂志，2002，19(5)：350-355.

〔5〕 Vieta Ⅰ,Savarino A,Papa G,et al.In vitro inhibitory activity of citreoviridin against H1V-1 and an HIV-associated opportunist: Candida albicans［J］.J Chemother,1996,8 (5): 351-357.

〔6〕 Robert DS,Judith IG,Odette LS.Liquid chromatographic method for determination citreoviridin in corn and rice［J］.J Assoc of Anal Chem,1988,71(4):721-724.

〔7〕 Linnett PE,Mitchell AD,Osselton MD,et.al.Citreoviridin,a specific inhibitor of the mitochondrial adenosine triphosphatase［J］.Biochem J,1978,170:503-510.