QuEChERS结合HPLC―MS/MS法测定鲜烟叶中的2种抑芽剂

摘要：建立鲜烟叶中二甲戊乐灵、仲丁灵2种抑芽剂的高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）检测方法。以乙腈为提取溶剂，对鲜烟叶中2种抑芽剂进行提取，采用新型复合吸附剂的quechers净化方法，用N-丙基乙二胺（PSA）、C18和石墨化碳黑（GCB）3种复合吸附剂净化，HPLC-MS/MS测定，以电喷雾正离子模式（ESI+），iFunnel离子聚焦，多反应监测（MRM）模式下进行检测，基质匹配外标法定量。通过优化条件，在10～500 μg/kg范围内，二甲戊乐灵、仲丁灵的检测线性相关系数（R2）均大于0.995，检出限（LOD）为1.5～2.4 μg/kg，定量限（LOQ）为5.0～7.9 μg/kg，在3个添加水平下的回收率范围88.1%～96.4%，相对标准偏差（RSD）为3.2%～9.3%。试验方法可用于鲜烟叶中二甲戊乐灵、仲丁灵抑芽剂的准确测定。

关键词： QuEChERS；复合吸附剂；抑芽剂；鲜烟叶；高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）

中图分类号：O657.7；TS41+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）11-2888-04

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.11.045

烟草抑芽剂主要包括马来酰肼、二甲戊乐灵、仲丁灵和氟节胺4种，可以提高烟叶产量和品质，其中二甲戊乐灵、仲丁灵（图1）在烟叶中的残留量较低，成为了目前成熟、研究多、应用广泛的2种烟草抑芽剂[1，2]，但有研究表明这2种抑芽剂可以毒害细胞并损害DNA，引发直肠癌和肺癌[3-5]。2014年，食品安全国家标准规定二甲戊乐灵和仲丁灵这2种抑芽剂的每日允许摄入量（ADI）分别为0.03和0.2 mg/kg[6]。抑芽剂关系到烟草质量安全，生产者需要对抑芽剂使用以及在鲜烟叶中的残留进行监测，以防止抑芽剂的滥用[7，8]。因此，建立快速、准确、灵敏的鲜烟叶中抑芽剂的检测方法迫在眉睫。

已有关于不同基质中抑芽剂类物质分析方法的研究报道，常见的前处理方法有液液萃取（LLE）[9]、固相萃取（SPE）[10]、凝胶渗透色谱法（GPC）[11，12]和QuEChERS[13，14]，这几种方法都存在一些不足之处，如LLE有机溶剂消耗量大，SPE操作复杂，GPC方法重现性不好。经典的QuEChERS方法虽简便快速，但采用单一吸附剂难以去除鲜烟叶中对质谱检测干扰较大的叶绿素、糖类、脂肪酸等杂质，也无法适用于鲜烟叶中抑芽剂的残留分析。关于鲜烟叶中抑芽剂的检测方法，国内鲜有相关文献报道，本研究采用新型复合吸附剂的QuEChERs净化方法，有效地去除鲜烟叶中杂质的干扰，结合hplc-ms/ms技术，能够快速、简便、准确地测定鲜烟叶中二甲戊乐灵、仲丁灵2种抑芽剂的残留。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：Agilent 1290高效液相色谱仪、Agilent 6490三重四极杆质谱仪（美国Agilent公司）；涡旋混合器（美国Scientific Industries公司）；离心机（美国Beckman Coulter公司）；超纯水系统（美国Millipore Milli-Q Gradient公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；氮吹仪（美国Caliper LifeSciences公司）；SR-2DS型水平振荡器（日本TATEC公司）。

试剂：甲醇、乙腈（色谱纯，美国Fisher Scientific公司）；石墨化碳（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）、C18（天津Agela Technologies公司）；二甲戊乐灵、仲丁灵（德国Dr. Ehrenstorfer公司）；甲酸（色谱纯，美国Sigma公司）；无水MgSO4、NaCl（分析纯，上海国药集团）。

标准溶液：准确称取二甲戊乐灵和仲丁灵标准品（精确至0.000 1 g），用甲醇分别溶解并配制成100.0 mg/L的标准储备液；混合2种标准溶液，临用前取标准储备液用甲醇稀释成10 mg/L的标准溶液，储存于4 ℃冰箱中备用。

1.2 试验方法

1.2.1 提取 取适量鲜烟叶，去除主脉，剪碎后放入均浆机中充分绞碎。准确称取绞碎的样品2.0 g，置于50 mL具塞离心管中，加入10 mL乙腈，在水平振荡器上振荡提取10 min，然后加入1.0 g无水MgSO4和0.5 g NaCl，立即涡旋1 min，防止无水MgSO4结块，最后以5 000 r/min离心8 min。

1.2.2 净化 吸取2.0 mL离心后的上清液，将上清液转移至装有30 mg C18、50 mg PSA和10 mg GCB吸附剂的5.0 mL离心管中，涡旋2 min，5 000 r/min离心3 min。吸取1.0 mL的上清液，用氮气吹至近干，残留物用甲醇∶水（9∶1，V/V）定容至1.0 mL后过0.22 μm滤膜，供HPLC-MS/MS分析。

1.3 测试条件

高效液相色谱条件Agilent Eclipse XDB-C18 column（150 mm×4.6 mm，5 μm），在线过滤器（Agilent 公司）；流动相A为甲醇，B为0.1%（V/V）甲酸水溶液；等度洗脱甲醇∶0.1%甲酸水（90∶10，V/V）；流速0.4 mL/min；运行时间13.0 min；柱温40 ℃；进样体积5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正离子模式；毛细管电压3 500 V；雾化气压力1.4×10-5 Pa（20 psi）；干燥气温度250 ℃；干燥气流量15 L/min；鞘气温度300 ℃；鞘气流量11 L/min；采集方式多反应监测模式（MRM），其他参数见表1。

2 结果与分析

2.1 QuEChERS方法的条件优化

2.1.1 提取溶剂 二甲戊乐灵、仲丁灵具有疏水性，难溶于水，易溶于有机溶剂乙腈、甲醇、乙酸乙酯等。使用甲醇、乙酸乙酯提取时，萃取杂质较多，且吸附剂净化效果不理想；乙腈对2种分析物的提取效率较高，吸附剂净化效果理想，并且对鲜烟叶中的色素、蜡质、脂肪等非极性成分提取的较少，通过盐析更容易去除乙腈中的水分，所以本试验选用乙腈作为提取溶剂[15]。

2.1.2 吸附剂的种类和用量 鲜烟叶中的叶绿素含量高，用PSA和C18净化时，叶绿素杂质几乎无法去除，有研究表明GCB是净化叶绿素的理想吸附剂，但对二甲戊乐灵和仲丁灵这种含有芳香环及对称性结构的物质有较强的吸附作用[16]。试验考察了GCB的用量对目标物质回收率的影响，随着GCB用量从5 mg增大到30 mg，提取溶剂虽更加澄清无色，但2种抑芽剂的回收率显著降低（图2）。当GCB用量为10 mg时，2种抑芽剂的回收率均在95%以上，满足检测要求。故选取10 mg GCB作为净化叶绿素的吸附剂。

PSA去除脂肪酸、有机酸和多糖的效果较好，但去除色素、甾醇的能力一般；C18可以去除部分色素、甾醇和脂肪，但对非极性物质有较强的吸附[15]；烟叶中含有叶绿素、脂肪和多糖等杂质较多，为了在灵敏度、回收率和净化效果之间找到最佳的平衡点，试验对C18-PSA-GCB复合吸附剂的用量比对净化效果的影响进行了考察，结果（图3）发现，采用以质量比3∶5∶1的C18-PSA-GCB 3种吸附剂，可获得最佳的净化效果，2种抑芽剂的平均回收率达到93%以上。因此，选择C18-PSA-GCB（3∶5∶1，质量比）为净化吸附剂。

综合以上因素，鲜烟叶用乙腈提取后，采用C18-PSA-GCB（3∶5∶1，质量比）吸附剂净化，不但回收率满足要求，而且减少了鲜烟叶中复杂基质对质谱离子源的污染。

2.1.3 色谱条件的优化 分别选用超纯水、乙腈和甲醇作为流动相进行考察，发现甲醇-水溶液作为流动相时，色谱峰和分离度达到最佳效果，进一步对比了甲醇-水溶液和甲醇-0.1%（V/V）甲酸水溶液体系为流动相，结果（图4）发现，以甲醇-0.1%（V/V）甲酸水溶液为流动相时的峰面积增加40%以上，这是因为在正离子模式下加酸有助于目标物质离子化。同时对Waters ACQUITY UPLC C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）和Agilent Eclipse XDB-C18 column（150 mm×4.6 mm，5 μm）2种色谱柱的分离效果进行了比较，发现XDB-C18对2种化合物的分离较好。

2.1.4 质谱条件的优化 目标物质属于苯胺类化合物，易于质子化，采用ESI+模式进行扫描。分别配制100 μg/L的2种单标准工作液，采用直接进样的方式注入离子源中，在m/z为100～1 000扫描范围内以正离子模式进行一级质谱扫描，发现目标化合物的[M+H]+峰较强；然后以此[M+H]+为母离子，进行子离子扫描，找到各物质的2个特征碎片离子（图5）。

2.1.5 线性关系、检出限和定量限 在优化的试验条件下进行了方法学的考察。配制二甲戊乐灵和仲丁灵2种抑芽剂的基质匹配标准溶液，分别为5、10、50、100、200、500 μg/kg，以提取离子色谱图的峰面积（y）为纵坐标，标准液浓度（x）为横坐标建立线性回归方程，在阴性样品中添加目标化合物，按照给定的方法测定，以3倍信噪比（S/N）对应的添加水平作为检出限（LOD），10倍信噪比（S/N）对应的添加作为定量限（LOQ），计算结果见表2。可见该方法切实可行。

2.1.6 回收率和精密度 用空白基质加标法进行回收率和精密度试验，选取阴性鲜烟叶为空白样品，分别添加相当于20、50和100 μg/kg水平的二甲戊乐灵和仲丁灵混合标准溶液，每个含量水平做6个平行样品，连续测定3 d，结果见表3。可见该方法准确度和精确度均较好。

3 结论

本研究优化了仪器参数和样品前处理条件，采用改进的QuEChERS-高效液相色谱串联质谱法，建立了鲜烟叶中二甲戊乐灵、仲丁灵2种抑芽剂的分析方法。该方法简单、快速、灵敏度高、准确度好、溶剂消耗量少，能有效去除叶绿素等杂质干扰问题，实现了复杂基质中目标化合物准确的定性和定量分析需求，可广泛用于鲜烟叶中二甲戊乐灵、仲丁灵2种抑芽剂的测定。该研究为抑芽剂的合理施用、大田的实时监控、鲜烟叶原料的残留控制提供了技术方法，对采取措施降低抑芽剂的危害具有现实意义。

参考文献：

[1] HAN F， JI X， LIU P， et al. Effects of different suckercides on economic characteristics and intrinsic quality of tobacco[J]. Journal of Food， Agriculture & Environment， 2012， 10（1）： 691-695.

[2] 陈德鑫，王凤龙，杨清林，等.烟草抑芽剂的研究进展与应用[J].安徽农业科学，2002，30（5）：792-796.

[3] PATEL S， BAJPAYEE M， PANDEY A K， et al. In vitro induction of cytotoxicity and DNA strand breaks in CHO cells exposed to cypermethrin， pendimethalin and dichlorvos[J].Toxicology in vitro，2007，21（8）：1409-1418.

[4] HOU L， LEE W J， RUSIECKI J， et al. Pendimethalin exposure and cancer risk among pesticide applicators：A report from the US-based agricultural health study[J]. Annals of Epidemiology，2004，14：608-643.

[5] ANDREOTTI G，FREEMAN L E B，HOU L，et al. Agricultural pesticide use and pancreatic cancer risk in the agricultural health study cohort[J]. International Journal of Cancer，2009， 124（10）：2495-2500.

[6] GB/T 2763―2014，食品安全国家标准食品中农药最大残留限量[S].

[7] 姜林灿.对烟叶原料保障上水平的探讨[J].中国烟草科学，2011， 32（6）：90-93.

[8] 潘义宏，周丽娟，王 娟，等.烟叶安全性影响因素及其关键农业控制技术研究进展[J].河南农业科学，2013，42（5）：5-11.

[9] TAHBOUB Y R， ZAATER M F， AL-TALLA Z A. Determination of the limits of identification and quantitation of selected organochlorine and organophosphorous pesticide residues in surface water by full-scan gas chromatography/mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2005，1098（1）：150-155.

[10] WONG J W，ZHANG K， TECH K， et al. Multiresidue pesticide analysis of ginseng powders using acetonitrile or acetone-based extraction， solid-phase extraction cleanup， and gas chromatography mass spectrometry/selective ion monitoring （GC-MS/SIM） or tandem mass spectrometry（GC-MS/MS）[J].Journal of agricultural and food chemistry，2010，58（10）： 5884-5896.

[11] 廖雅桦，蒋腊梅，穆小丽，等.凝胶渗透色谱-高效液相色谱-串联质谱法同时测定烟草中3种抑芽剂残留[J].分析试验室，2010（1）：72-75.

[12] LIU H，DING C，ZHANG S，et al. Simultaneous residue measurement of pendimethalin，isopropalin，and butralin in tobacco using high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection and electrospray ionization/mass spectrometric identification[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004， 52（23）：6912-6915.

[13] 朱文静，高川川，楼小华，等.LC-MS/MS快速测定烟草中57种农药残留[J].中国烟草学报，2013（2）：12-16.

[14] CHEN X，BIAN Z，HOU H，et al. Development and validation of a method for the determination of 159 pesticide residues in tobacco by gas chromatography-tandem mass spectrometry[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61（24）：5746-5757.

[15] 张耀海，焦必宁，周志钦.气相色谱-串联质谱法结合QuEChERS方法快速检测软包装饮料中8种光引发剂[J].分析化学，2012（10）：1536-1542.

[16] 宋淑玲，李重九，马晓东，等.蔬菜中残留农药的石墨化碳黑净化和气相色谱-质谱检测方法[J].分析化学，2008，36（11）：1526-1530.