猕猴大脑中动脉缺血后海马CA1区结构改变及胰岛素样生长因子-1的表达

[摘要]目的：探讨猕猴大脑中动脉阻塞/再灌（MCAO）后海马CA1区胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的表达。方法：采用猕猴MCAO模型，缺血2 h,再灌24 h，用免疫组化方法检测脑缺血后IGF-1蛋白的表达。结果：MCAO后缺血侧海马CA1区形态结构改变，神经元密度降低，IGF-1蛋白阳性细胞数与假手术组比较明显减少(P

[关键词]大脑中动脉阻塞/再灌（MCAO）；胰岛素样生长因子-1；免疫组织化学；猕猴

[中图分类号]R361[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2007）06（a）-019-02

生长因子家族在缺血性脑损伤中具有重要的作用， 胰岛素样生长因子-1（IGF-1）是生长因子家族中重要的一员，参与许多生理功能及行为的调节，具有很强的神经保护作用，是机体在脑缺血再灌注导致神经细胞损伤的同时可引发的自我保护机制。但是，IGF-1在脑缺血后的表达尚存争议[1]，因此，我们在猕猴ＭＣＡＯ模型上采用免疫组化方法观察脑缺血IGF-1蛋白质的表达，分析IGF-1在脑缺血损伤中可能的作用。由于实验条件的限制，目前研究多用大鼠、兔、猪、猫和狗，而灵长类动物很少。但这些动物与人差别巨大，而猕猴（Macaca mulatta）生物学特性与人类相近，是研究脑缺血理想的实验动物 [2]，本研究是猕猴脑缺血研究的部分内容，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

13只实验猕猴(Macaca mulatta)，雌雄不拘，3~4.5岁,体重（4.35±0.23） kg，由中国科学院上海生理所提供，经检疫确认无传染性疾病，可供实验研究用。假手术组（n=5），缺血组（n=8）。

1.2 实验试剂

免疫组织化学试剂盒DAB由华美生物工程公司生产，原位杂交试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司生产，IGF-1单克隆抗体由美国RDI公司生产。

1.3 猕猴MCAO模型的制备

使用Gao等[3]的方法，该法已经获国家发明专利（专利号：CN200410075763.9）。简述如下：由于开颅MCAO以及经眼眶法阻塞血管容易形成血管痉挛，血管内栓子法又无法控制何时再灌，因此,利用血管内栓子法不直接对血管造成损伤的优点，克服栓子法的缺点，用可充气球囊代替栓子，可以任意控制脑缺血的时间和程度。导管由一个微小的球囊和与之相连的细导管及注射器组成。通过注射器注入微量的气体使球囊充盈，从而阻断血管内的血流，抽掉气体后球囊消失使血流再通。

1.4 病理切片(H&E染色)

再灌24 h后，左心室插管，灌注固定后取脑，置于4℃ 含20%蔗糖+4%多聚甲醛溶液中至下沉，然后移入4℃含30%蔗糖的固定液中再至下沉。连续冠状石蜡切片，厚度6 μm，每隔20张切片选取1张。H&E染色。中性树胶封片。光学显微镜下观察。

按照猕猴脑图谱[4]冠状面A17.0平面，光镜下分别对缺血侧及对照侧(缺血对侧)的海马CA1区进行细胞计数，方法如下：标定所选区域，在镜下找到标志点，在其周围随机选取3个视野，对视野内细胞计数，取3个视野平均值。计算残存细胞百分率的方法：缺血侧细胞计数占其缺血对侧细胞计数的百分率。

1.5 免疫组化染色

免疫组织化学染色方法按试剂盒说明书进行。阴性对照不加一抗，其余步骤同上。

1.6 统计学处理

全部数据用x±s表示。统计学处理:使用SPSS11.0软件进行数据处理。组间比较用方差分析。

2 结果

2.1 海马CA1区形态学改变及神经元密度

本实验H&E染色结果显示，假手术组海马CA1区细胞排列整齐而且紧密，锥体细胞有2~3层，锥体细胞的核圆润，核仁清晰，可见浅染的突起，神经元密度为180.8±14.01（图1A）。缺血组海马CA1区锥体细胞稀疏，结构松散，层次不清，有的细胞旁有空染区，可见神经细胞染色较淡，细胞数量明显减少，细胞肿胀，细胞核体积缩小、固缩、碎裂、溶解，神经元密度为81.8±11.21（图1B）。二者比较有显著性差异（P

2.2 脑缺血后脑内IGF-1蛋白的表达

缺血2 h再灌注24 h后，缺血侧IGF-1蛋白阳性物质的细胞弥散分布于皮质、纹状体和海马等部位，海马内IGF-1阳性物质的表达降低（如图2所示）。IGF-1阳性细胞定量分析表明，假手术组IGF-1阳性细胞数是34.62±0.97，缺血组是15.11±1.83。与假手术对照组相比，缺血再灌注后24 h海马内IGF-1蛋白表达降低（P

3 讨论

中枢神经系统对缺血缺氧的敏感度和耐受能力有所不同，其中以海马以及纹状体等结构对缺血最为敏感[5。本实验的目的是观察猕猴局灶性脑缺血后海马CA1区神经元损伤程度以及IGF-1的表达。

严重的缺血缺氧导致神经元的IGF-1 mRNA立即下降，并因此增加凋亡细胞数[6]，但是也有相反的报道：Gluckman等[1]用大鼠脑缺血模型研究发现，一侧颈动脉短暂结扎造成的短暂脑缺血损伤后90 min，缺血侧IGF-1 表达水平升高，并认为这种IGF-1水平的升高可能是生理性的应激反应。在纹状体缺血中心区神经细胞IGF-1 mRNA表达较弱，脑缺血周边区表达增强，与其相应的蛋白表达的分布基本一致。在脑缺血中心区，能量供应障碍导致细胞坏死或不同程度的损伤，因而基因表达微弱；而在缺血周边区细胞损伤较轻，基因表达相对较强。

缺血缺氧性脑病患儿窒息后24h内脑血管阻力指数异常增高说明脑血流减少，甚至无血流，血管严重痉挛，处于低灌注期。电镜下微血管周围星状胶质细胞肿胀及微血管内皮细胞产生疱疹样改变，脑内微血管狭窄，使脑组织灌注障碍进一步加重。Gillespie等[7]给大鼠持续静脉注射IGF-1 60 min [125 μg/（kg・h）]，脑血管阻力较对照组降低60%，说明在缺血缺氧早期使用IGF-1可以改善组织的灌流。

缺血缺氧时由于钙泵功能失调导致细胞内钙超载，继而发生一系列有关的酶反应，最后导致不可逆的细胞损伤。可是Chik等[4]在研究松鼠体细胞时发现IGF-1通过调节络氨酸磷酸化过程可以阻止L型钙离子通道的开放，从而减少钙离子的内流。Yasui等[8]发现自发性高血压大鼠的海马脑片上CA1区易受缺血损伤，使用钙离子通道拮抗剂可以起到神经保护作用；后来Matton等[9]观察到营养因子可以通过调节细胞内钙的稳态来保护神经元免受谷氨酸兴奋毒性以及缺血的损伤，使用钙指示剂fura-2 和全细胞膜片钳记录技术发现撤掉葡萄糖后开始引起钙电流的抑制以及早在还没有形态学上细胞受损的迹象时细胞内自由钙水平下降；去除葡萄糖12~16 h，细胞内钙大量积聚，NMDA 受体激活,从而介导细胞的损伤和死亡，IGF-1以剂量依赖的方式调节神经元因缺糖引起的细胞内钙稳态失衡，使神经元免受能量不足造成的损伤；撤除葡萄糖后12 h才使用生长因子仍可以看到不同程度的神经保护作用。在细胞可以存活的时间窗内IGF-1等通过稳定细胞内钙平衡来保护神经元因缺氧引起的损伤。

本实验结果表明MCAO缺血侧海马CA1区结构改变，IGF-1蛋白表达减少，可能与海马严重的缺血缺氧有关，提示海马内IGF-1在脑缺血损伤中可能具有一定的作用。进一步详细的分子机制尚需进一步研究。

[参考文献]

[1]Gluckman PD.Editorial:nutrition, glucocorticoids,birth size, anddisease[J].Endocrinology,2001,142(5):1689-1691.

[2]Moossy J.Morphological validation of ischemic stroke models.in Price TR,Nelson E(eds):Cerebrovascular Diseases.Eleventh Princeton Conference on Cerebrovascular Diseases[C].New York:Raven Press,1979.3-10.

[3]Gao Huan-min,Guo Jing-chun,Zhao Peng.et al.The neuroprotective effects of electroacupuncture on focal cerebral ischemia in monkey[J]. Acupuncture & Electrotherapeutics Res,2002;27(1):45-57.

[4]Chik CL, Li B, Karpinski E, et al. Regulation of the L-type Ca2+ channel current in rat pinealocytes:role of basal phosphorylation[J].J Neurochem, 1999 ,72(1):73.

[5]Memzawa H, Smoth Ml，Siesjo BK. Penumbral tissues salvaged by reperfusion following middle cerebral artery occlusion in rats[J].Stroke,1992,23(4):552.

[6]Clawson TF,Vannucci SJ,Wang GM,et al.Hypoxia-ischemia-induced apoptotic cell death correlates with IGF-1 mRNA decrease in neonatal rat brain[J].Biol Signals Recept, 1999,8(4):281.

[7]Gillespie CM, Merkel AL, Martin AA. Effects of insulin-like growth factor-I and LR3IGF-I on regional blood flow in normal rats[J].J Endocrinol, 1997,155(2):351.

[8]Yasui M, Kawasaki K.Vulnerability of CA1 neurons in SHRSP hippocampal slices to ischemia, and its protection by Ca2+channel blockers[J].Brain Res,1994，642(1-2):146.

[9]Matton MP,Cheng B.Growth factors protect neurons against excitotoxic/ischemic damage by stablizing calcium homeostasis[J].Stroke,1993,24(12):II36.

(收稿日期：2007-04-12)

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