海棉基因荧光组建

【前言】海棉基因荧光组建由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。1．2．2T－easy－GbHOX4载体构建。将RNA按照Primescript1ststrandcDNAsynthesiskit（TaKaRa，D6110S）说明书反转录成单链cDNA，利用Primerpremier5和Oligo6软件设计引物，HOX4－F：5′－GGCGTTTTCAGGGATTTTTCCAG－3′；HOX4－R：5′－TTCTCCACAAGCGGTTCGTTCT－3′。利...

在拟南芥表皮毛中，GL2是一种Homeobox（同源异型盒）基因，编码一种转录因子，且表达于整个表皮毛发育过程，其突变体gl－2表现为表皮毛退化［1－2］。在棉花中已经克隆到与GL2同源的HOX1、HOX2、HOX3三个基因，其中HOX1能完全恢复其gl－2的表型，HOX3能部分恢复gl－2的表型［3－5］。本研究以海岛棉Giza75、陆地棉SG747以及高世代回交重组自交系为材料，利用基因芯片技术筛选得到与棉花纤维长度相关的基因HOX4，该基因的具体功能没有进一步的验证。绿色荧光蛋白（Greenfluorescentprotein，GFP）是来自于海洋腔肠动物水母体内的一种天然发光蛋白，由237个氨基酸组成，当用紫外光照射时，GFP发出绿色荧光［6］。GFP由于其具有荧光稳定、检测方便可靠、无物种特异性、对植物体无毒害、可以活体检测等优点［7－10］，在植物遗传转化研究中作为报告基因得到了广泛应用［11］。本研究通过聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction，PCR）技术从海岛棉中克隆到了GbHOX4基因，并对其进行了序列分析及荧光载体的构建，旨在为进一步研究该基因在纤维发育中的作用以及目的基因在宿主细胞中的亚细胞定位研究奠定基础。

1材料和方法

1．1材料海岛棉Giza75种植于中国农业科学院棉花研究所，按一般大田管理；本课题改良带有绿色荧光蛋白标签的pBI121载体；T－easy载体购自Pro－mega；限制性内切酶BamHI购自NEB公司；Marker、大肠杆菌感受态细胞DH5α购自TIAN－GEN；DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；质粒小提试剂盒购自上海生工；In－fusion酶、反转录试剂盒、Taq酶购自TaKaRa公司；其余试剂均为国产分析纯。

1．2实验方法

1．2．1RNA的提取。取开花后10d的海岛棉的棉铃，所剥的纤维放入液氮，－70℃保存备用，利用本实验室改良的CTAB／酸酚法提取纤维的RNA［12］。

1．2．2T－easy－GbHOX4载体构建。将RNA按照Primescript1ststrandcDNAsynthesiskit（TaKaRa，D6110S）说明书反转录成单链cDNA，利用Primerpremier5和Oligo6软件设计引物，HOX4－F：5′－GGCGTTTTCAGGGATTTTTCCAG－3′；HOX4－R：5′－TTCTCCACAAGCGGTTCGTTCT－3′。利用宝生物预混的Taq酶进行PCR反应，反应体系（50μL）为：cDNA1μL，预混的Taq酶25μL，超纯水24μL。PCR的反应条件为：98℃预变性3min后进入循环：98℃，30s；60℃，30s；72℃，2．5min；共30个循环；最后72℃延伸10min，利用琼脂糖凝胶电泳观察结果。PCR产物胶回收，将目的基因与T－easy载体连接，转化大肠杆菌DH5α，在含有氨苄的平板培养基上筛选白色菌落，经菌落PCR鉴定后将阳性重组子测序，测序由上海生工完成。1．2．3pBI121－GbHOX4－GFP载体构建。按照In－fusion酶连接试剂盒说明书设计Infusion－HOX4－GFP引物，以测序正确的阳性重组子为模板，以In－用酶为宝生物高保真Taq酶，反应条件为：98℃预变性3min后进入循环：98℃，30s；60℃，5s；72℃，2min；共30个循环；最后72℃延伸10min，对目的PCR产物进行胶回收。用限制性内切酶BamHI酶切带有GFP标签的pBI121表达载体，从而形成线性化载体。把PCR产物和该线性化载体在In－fusion酶的作用下进行重组，构建pBI121－GbHOX4－GFP载体。

2结果与分析

2．1海岛棉GbHOX4基因的克隆与鉴定所提取的海岛棉（Giza75）纤维RNA条带清晰，没有降解、没有蛋白和糖类残留（图1）。根据已公布的陆地棉GhHOX4序列设计适当引物，以海岛棉Giza75第一链cDNA为模板，通过PCR扩增得到约2500bp的片段（图2）。将PCR产物与T－easy载体连接，转化大肠杆菌，经蓝白斑筛选、菌落PCR验证后送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序，证明目的片段已经克隆至T载体上。将此克隆载体命名为T－easy－GbHOX4（图3）。

2．2海岛棉GbHOX4基因序列分析通过蛋白质结构功能域分析网站可得：海岛棉GbHOX4为Homeobox（同源异型盒）基因，编码一种转录因子（图4）。通过和已知的Gh－HOX4比对，GbHOX4与其有99％的相似性，在保守区内GbHOX4和GhHOX4有100％的相似性（图5）。图5中有下划线的为保守同源异型盒结构域。

2．3pBI121－GbHOX4－GFP载体构建构建pBI121－GbHOX4－GFP载体，转化到大肠杆菌DH5a后，从平板上筛选卡那霉素抗性菌落，进行PCR鉴定，能检测到2277bp的克隆即为阳性克隆（图6）。在设计引物过程中，把GbHOX4基因的终止密码子TAA改为了CAA，CAA和绿色荧光蛋白起始密码子ATG两者之间有27个碱基，为3的倍数，从而使GbHOX4基因和GFP能形成融合蛋白（图7）。3讨论由于GFP蛋白无毒、所发荧光稳定以及荧光产生不需要外源底物，因而近年来在细胞分子生物学中得到了广泛的应用。随着研究的不断深入，GFP在植物分子生物学中的应用空间也大大拓展，现已广泛地应用于转基因植物的动态监测、目的蛋白的亚细胞定位、病原微生物的分布和与植物的相互作用的观察以及细胞器间信息、物质交换。HOX基因编码一类转录调节因子，其表达蛋白通过特异性地结合DNA，调控动植物的发育和细胞的生长及分化。同源异型盒（Homeobox）简称同源盒或同源框，是存在于真核生物中的一段高度保守的、约180bp的DNA序列。本试验克隆到GbHOX4基因，进行了pBI121－GbHOX4－GFP载体的构建，为今后用基因枪法将该载体转入洋葱表皮细胞中，观察基因的瞬时表达，并且为基因的遗传转化、基因表达及在转基因植物细胞中的定位和生物学功能分析奠定了基础。