猴头菇多糖脂质体包封率的测定方法及其稳定性研究

[摘要] 目的 对猴头菇多糖脂质体进行质量和稳定性评价，测定猴头菇多糖脂质体包封率和进行脂质体稳定性考察。 方法 采用超滤法分离脂质体与游离药物；采用紫外分光光度法，最大吸收波长为（625±1）nm，测定药物含量，计算包封率；分别在40、60、80℃下对脂质体的化学稳定性和物理稳定性进行考察。 结果 超滤法能很好的将脂质体与游离药物分离，游离药物的平均回收率为96.3%，加样回收率为95.9%，脂质体不能透过超滤膜；加速试验中40、60℃下稳定性较好。 结论 该方法可用于猴头菇多糖脂质体的质量控制。

[关键词] 超滤法； 猴头菇多糖； 脂质体； 包封率；稳定性

[中图分类号] R283.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）08（c）-0118-04

猴头菌Hericium erinaceus（Bull. Ex Fr.）又名刺猬菌、猴头菌、小刺猴头、猴菇、猴头蘑，是一种大型真菌，隶属于担子菌门，齿菌科[1]，据报道，猴头菌所含有的营养成分与目前人工栽培的其他食用菌相比都居前两位[2]。它富含蛋白质、各种氨基酸、维生素C、维生素B1、尼克酸、铁、锌等各种营养成份[3]。而猴头菇多糖是猴头菌的主要活性成分之一，具有免疫调节、抗肿瘤、降血脂、降血糖、防辐射等作用[4]。猴头菇多糖制成的药物和保健品深受人们喜爱，开发前景广阔。但多糖是一种不太稳定的化学物质，进入体内后，会受到各种胃肠酶的攻击而降解，失去部分药效活性，而将猴头菇多糖制成脂质体制剂，口服给药可以提高生物利用度。包封率是评价脂质体质量的重要指标，也是其发挥疗效的关键[5]。为了评价猴头菇多糖脂质体的质量，笔者建立了超滤法紫外法测定灯猴头菇多糖脂质体包封率的方法，为猴头菇多糖脂质体的质量评价提供依据。脂质体在放置过程中可能发生多种不同的变化，这些变化都会在不同程度上影响脂质体的质量，因此一个成熟的脂质体制剂必须在贮藏期间具有良好的稳定性，以保持其粒子的大小和完整性。本文用稳定性加速实验考察了猴头菇多糖脂质体的包封率、磷脂氧化指数、粒径、稳定性参数等多项指标，为其贮藏条件的选择提供了依据。

1 材料与仪器

紫外可见分光光度仪GBC Cintra 10（澳大利亚GBC公司），Minitan小型超滤装置（日本MILLIPORE公司），旋涡混合振荡器（江苏海门其林医用仪器厂），恒温水浴锅（北京靖卫科学仪器厂）。D-无水葡萄糖（中国药品生物制品检定所），蒽酮（北京金龙化学试剂有限公司），浓硫酸、95%乙醇、三氯甲烷均为分析纯，猴头菇菌丝体为：5号菌株（购自福建三明真菌研究所），猴头菇多糖为本实验室自制。

2 方法与结果

2.1 猴头菇多糖的提取

取成熟的猴头菇菌丝体发酵液，过滤，滤液离心，得上清液于60℃下减压浓缩，过滤，滤液离心，取上清液，加入5倍体积的无水乙醇，静置过夜，沉淀抽滤，再用无水乙醇、丙酮洗涤，置干燥箱中60℃干燥，粉碎，得粗多糖。

2.2 猴头菇多糖脂质体的制备

采用乙醇滴注法制备脂质体。将磷脂、胆固醇、VE辅料溶于适量的乙醇溶液中，完全溶解后滴入60℃恒温药液中，边滴边搅拌，滴注速度越小越好，滴注结束后药液恒温搅拌10 min，旋转蒸发除去乙醇，将得到的溶液用蒸馏水定容，再保温1 h，冷却，过滤，即得。

2.3 实验方法

紫外分光光度法测定，取葡萄糖对照品制成浓度为0.5 mg/mL的对照品溶液，猴头菇多糖样品制成浓度约为30 μg/mL的溶液。对照品、样品溶液各取1 mL加入4 mL的0.1%蒽酮-硫酸溶液，摇匀，置沸水中煮沸10 min，取出迅速放冷，在黑暗中放置10 min显色，在波长625 nm下测定含量。

2.4 专属性实验

精密量取空白脂质体及含药脂质体各1 mL，加少许NaCl和三氯甲烷于10 mL容量瓶中；置50℃水浴3 min，用旋涡混合振荡器将脂质体破坏，蒽酮-硫酸法显色后用紫外分光光度法测定，结果阴性无干扰。

2.5 标准曲线的绘制

精密称取葡萄糖对照品，配成浓度为0.5 mg/mL的对照品溶液，再配制成浓度分别为0、20、40、60、80、100 μg/mL的溶液，精密吸取各个浓度对照品溶液1 mL分别置于试管中，照“2.1”项下显色方法显色，在625 nm波长处测定吸光度值，计算得回归方程：y = 0.007x - 0.0133，r = 0.999。结果表明，葡萄糖液在20～100 μg/mL与吸光度值呈良好的线性关系。根据测定结果计算标准曲线方程。本方法适用于测定浓度在20～100 μg/mL的猴头菇多糖。

2.6 精密度试验

取浓度为0.5 mg/mL的对照品溶液，共配制5份同样的稀释液，按标准曲线项下操作。结果RSD为0.85%（n =5），表明精密度良好。

2.7 药物总含量回收率试验

分别精密量取1 mL空白脂质体溶液， 加入至0.5、1、1.5 mL葡萄糖对照品溶液（40.5 μg/mL）中，每个浓度各3份， 每份加少许NaCL和三氯甲烷于10 mL容量瓶中；置50℃水浴3 min，于旋涡混合振荡器中破坏脂质体，用纯化水稀释定容，按“2.1”项下试验，计算平均回收率为98.60%，RSD为1.66%（n = 9）。见表1。

2.8 游离药物回收率试验

配制低、中、高3个浓度（相当于葡萄糖浓度为20、40、60 μg/mL）的药物水溶液各3份，分别取10.0 mL至超滤器中进行超滤， 收集续滤液。将超滤后的药物溶液用水稀释至适当浓度，按“2.1”项下方法进样分析，计算平均回收率为96.30%，RSD为0.80%（n = 9）。见表2。

2.9 超滤加样回收率试验

精密量取葡萄糖对照品溶液适量，加至空白脂质体中， 使葡萄糖对照品溶液浓度分别为20、40、60 μg/mL，每个浓度各做3份，分别取该溶液10.0 mL至超滤器中进行超滤，收集续滤液，将超滤后的药物溶液用水稀释至适当浓度，按“2.1”项下方法进样分析，计算平均回收率为95.93%，RSD为1.18%（n = 9）。见表3。

2.10 超滤膜对空白脂质体透过能力的考察

取空白脂质体10.0 mL于超滤器中进行超滤， 收集超滤液，用定磷法[6]测定超滤液中磷的含量。结果滤液中检测不到磷，说明该方法中超滤膜对脂质体能够完全截留。

2.11 包封率的测定

取猴头菇多糖脂质体10.0 mL放至超滤器内，用超滤膜超滤，收集续滤液。精密量取该滤液适量，加蒸馏水至10 mL，按“2.1”项下方法进样测定，计算游离药物含量C游离；精密量取猴头菇多糖脂质体溶液1.0 mL，用旋涡混合振荡器中破坏后，破乳后加蒸馏水至10 mL，摇匀，4℃放置至上层液澄清。取上清液按“2.1”项下方法进样测定，计算脂质体中药物总含量C总，并计算包封率[7-8]，包封率=（C总-C游离）/C总×100%。结果见表4。

2.12 猴头菇稳定性试验考察

2.12.1不同的灌装方法下的脂质体化学稳定性考察

取按“2.2”项下制剂方法制备的药液，用微孔滤膜过滤，滤液按不同方法分装至安瓿瓶中。样品1：直接封瓶；样品2：在瓶中充满氮气后封瓶。将各批样品分别以包封率和渗漏率、氧化指数作为猴头菇多糖脂质体的稳定性考察指标考察其稳定性，结果见表5。取药液浓度为0.8 mg/mL的样品1和样品2，分别置于40、60、80℃的恒温水浴中放置10 d，分别于0、1、3、5、10 d取样，测定猴头菇多糖脂质体的包封率、渗漏率和氧化指数。包封率测定方法见“2.11”项下方法。

2.12.1.1 渗漏率的测定[9] 精密量取猴头菇多糖脂质体溶液适量，加蒸馏水至10 mL，按“2.1”项下方法进样测定，计算包封的药物含量C包封；精密量取贮存一定时间后的猴头菇多糖脂质体溶液适量，加蒸馏水至10 mL，按“2.3”项下方法进样测定，计算渗漏到介质中的药量C渗漏。取两次测得的结果按下式计算渗漏率：渗漏率=C渗漏/C包封×100%

2.12.1.2 氧化指数的测定 精密量取猴头菇多糖脂质体5 mL加少许固体氯化钠和5 mL三氯甲烷在50℃水浴中放置5 min，然后涡流振荡3 min，取下层液分别采用紫外分光光度法在233 nm和215 nm处测吸光度A，按下式计算：氧化指数=A233nm/A215nm

2.12.2 脂质体物理稳定性考察

稳定性参数Ke的测定：取灌装好的猴头菇多糖脂质体，置于40、60、80℃的恒温水浴中放置10 d，分别于0、1、3、5、10 d取样。精密量取样品液0.5 mL于25 mL量瓶中，用水定容至刻度；另取3 mL样品溶液离心，离心速度为5000 r/min，时间为5 min，精密量取0.5 mL上层液于25 mL量瓶中，用水定容至刻度，分别测定两份供试品在500 nm处的吸光度D0值和D值，按下式计算稳定性参数Ke：Ke =（D0-D）/D0；D0代表离心前脂质体吸光度，D代表离心后脂质体吸光度。

2.12.2.1 光学显微镜法测定粒子大小[10] 取脂质体于16×100倍显微镜下观察20个视野，无大粒子（≤2 μm）记为“-”，有1～2个大粒子（>2 μm）记为“++”，有多个大粒子（>2 μm）记为“+++”。

2.12.2.2 外观形态变化观察 猴头菇多糖脂质体物理稳定性变化表现为分层；颜色轻微变化；分层后上层颜色加深，下层产生沉淀。评价方法：不分层，无沉淀标记为“---”；不分层有少许沉淀，稍微振摇后均匀稳定记为“--+”；不分层，有沉淀，用力振摇可均匀记为“-++”；分层，有沉淀记为“+++”。见表6。

3 讨论

脂质体包封率测定的常用方法有：分子排阻色谱法、微柱离心法、透析法、离心法、超滤离心法、离子交换色谱法、NMR法、荧光法、电子自旋共振法（ESR）凝胶过滤法、鱼精蛋白凝聚法等[11]。本课题曾经尝试用可制备分离的HPLC进行游离药物的分离，使用shodex柱，流动相为纯化水；流速：1 mL/min；检测波长：280 nm；通过HPLC的工作站可以得到脂质体与游离药物的分离图谱直接接取流出液进行游离药物含量测定，实验中发现脂质体与游离药物的分离时间较长，游离药物流出液浓度较低其吸光度易受到溶剂的干扰，得到的分析结果不好。而采用透析法则药液用量大，透析时间长，且游离药物的浓度较低不好测定其含量。在采用超滤法分离猴头菇多糖脂质体与游离药物时，脂质体样品不用稀释既可超滤，可降低稀释所带来的药物渗漏和吸光度小测定值误差大的缺点，所用脂质体量少只需10 mL，而且分离速度较快。该法操作快速、简单、重现性好。为了考察试验方法的准确性，实验中对药物脂质体的破坏方法、游离药物的超滤、空白脂质体加样后均做了回收率考察，实验考察中选取高、中、低3个药物浓度来考察回收率，结果表明，在此浓度范围内回收率均大于95.0%，以上几步测定环节的准确性均能够达到要求。

稳定性是脂质体走向工业化所面临的一个关键问题。脂质体在放置过程中可能发生多种不同的变化，比如药物发生分解、磷脂氧化、包封药物发生渗漏等[12]，这些变化可能影响脂质体的体内行为，因此对脂质体的稳定性人们做出了很多研究，例如针对脂质体稳定性发生变化时会在膜中形成具有溶血性的衍生物，有人提出制备脂质体应控制氧化指数[13]。本实验中稳定性考察指标之一就是氧化指数，因氧化偶合后的磷脂在230 nm左右有紫外吸收，而未氧化的磷脂在215 nm左右有紫外吸收，故分别测定了230 nm和215 nm下的紫外吸收求得氧化指数。另外，脂质体还可能发生凝聚、融合等物理变化，从而导致包封药物的渗漏。这些都大大限制了其作为药物载体的应用。本文针对以上问题做出了相应的稳定性研究。实验结果可以看出，包封率在80℃时脂质体状态完全发生变化，无法测定，60℃时有微小变化，40℃不变。分析原因为膜的流动性受温度的影响：磷脂从凝胶到液晶状态的相转移时膜流动性增加，膜的厚度减小，面积增加，膜往往呈现较大的通透性[14]，此时脂质体释药最多，包封率下降。也有相反的论断，认为膜在相变温度时并不显示最大通透性，这可能与膜材种类有关[15-16]。本实验符合前一种理论。目前尚无方法完全防止磷脂氧化的方法，只能采取一些措施尽可能的降低氧化程度。例如避免高温，在脂质体膜材组成中加入抗氧剂等[17]。目前最常用的抗氧剂为α-生育酚，磷脂的氧化分解可因α-生育酚的加热大大减缓，也有文献报道同时加入胆固醇和α-生育酚可发挥协同抗氧化作用[18]，本文在猴头菇多糖脂质体制备过程中除加入了α-生育酚和胆固醇外还将脂质体冲氮贮存于惰性环境中，避光保存，避免射线辐射也可以提高脂质体的化学稳定性。

[参考文献]

[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1999：522-524.

[2] 樊伟伟，黄惠华.猴头菇多糖研究进展[J].食品科学，2008，29（1）：355-358.

[3] 张绪东，包海花，念红，等.猴头菇浓缩液对小鼠运动性疲劳的影响[J].牡丹江医学院学报，1999，20（1）：1-2.

[4] 胡斌杰，师兆忠.超声法提取猴头菇多糖最佳工艺优化研究[J].化学世界，2009，9：557-560.

[5] 陈召红，刘皈阳，魏亚超.脂质体包封率测定方法研究进展[J].药学学报，2011，27（1）：79-82.

[6] 雷国峰，陈琳，邓英杰，等.超滤法-HPLC法测定灯盏花素脂质体包封率[J].沈阳药科大学学报，2006，23（4）：237-239.

[7] 李哲，王绍宁，黄微葳，等.盐酸伊立替康脂质体的制备及包封率的测定[J].沈阳药科大学学报，2011，28（9）：687-690.

[8] 张明，张露，赵应征，等.应用不同类型脂质体作为姜黄素经皮给药载体的实验研究[J].温州医学院学报，2011，41（4）：324-328.

[9] 范一文，鲁群，李地才，等.茶多酚脂质体的制备和物化性质研究[J].现代食品科技，2011，27（10）：1187-1191.

[10] 王永利，王立华，李维爽，等.大黄酚脂质体的制备及其质量评价[J].中草药，2011，42（6）：1119-1121.

[11] 邵红霞，奉建芳，龙晓英.脂质体包封率的测定方法[J].中南药学，2009，7（3）：212-215.

[12] 袁松，孙会敏，丁丽霞.脂质体物理化学稳定性研究进展[J].中国药事，2011，25（4）：384-388.

[13] Klein RA.The detection of oxidation in liposomes preparation [J]. Biochim Biophys Acta，1980，210：486-491.

[14] Bresseleers GJ. Measurement of the gluose permeation rate across phospholipid bilayers using SUV [J]. Biochim Biophys Acta，1984， 772（3）：374-381.

[15] Braganza LF. Dye permeability at phase transtions in single and binary component phosholipid bilayers [J]. Biochim Biophys Acta，1983， 731（2）：137-146.

[16] Elamrani K. Effect of the lipid phase transition on the kinetics of H+/OH- diffusion across phosphatidic acid bilayers [J]. Biochim Biophys Acta，1983，727（1）：23-30.

[17] 贾献慧，唐文照，闫军.丹皮酚脂质体的研制及其体外释放研究[J].中成药，2011，33（2）：255-258.

[18] Hernandez-Caselles T. Stability of liposome on long term storage [J]. J Pharm Pharmacol，1990，42：397-405.

（收稿日期：2013-06-27 本文编辑：卫 轲）