基于水滑石―金纳米粒子的阻抗型核酸适配体传感器的研究

摘 要 在玻碳电极表面用电化学沉积法一步合成钴铝水滑石-金纳米粒子（CoAl LDH-GNPs）复合纳米材料，以复合纳米材料作为核酸适配体（Apt）的固定化基质，建立了一种高灵敏的阻抗型适配体传感器。采用扫描电镜（SEM）和能量色散谱仪（EDS）对CoAl LDH-GNPs复合纳米材料进行了表征，对电极的组装过程采用循环伏安法和电化学阻抗进行表征，对传感器的性能采用电化学阻抗进行研究。复合纳米材料CoAl LDH-GNPs构筑的传感器对凝血酶（THR）具有良好的信号响应，线性相关系数R=0.995，检出限为0.3 ng/L（S/N=3），检测范围为1.0 ng/L～100 μg/L。

关键词 水滑石复合纳米材料； 阻抗型； 核酸适配体传感器； 凝血酶

1 引 言

凝血酶是人体内不可或缺的一种生理蛋白酶，具有快速止血的作用，能使血浆内的纤维蛋白原从可溶性转变成不溶性。在伤口愈合、凝血等病理和生理过程中扮演着关键的角色，故对凝血酶的测定在临床应用和病理分析上具有十分重要的现实意义[1，2]。核酸适配体是由指数富集配体系统进化技术（SELEX）筛选产生的单链DNA或RNA，能与蛋白质、多肽、氨基酸和生物小分子等物质发生特异性结合。以核酸适配体与凝血酶的特异性结合为基础构建的测定凝血酶的核酸适配体传感器的研究十分活跃，已有采用不同的检测方法如电化学[3，4]、荧光[5]、电化学发光[6]和表面等离子体共振[7]等检测凝血酶的报道。其中，电化学检测方法中的电化学阻抗技术具有灵敏度高、简单、非标记等优点，近年来，电化学阻抗型核酸适配体传感器的研究备受关注。在这些研究中，为了提高电化学阻抗型核酸适配体传感器的灵敏度，纳米材料，如金纳米粒子（GNPs）[8]、碳纳米管[9]、石墨烯[10]和石墨烯-金纳米粒子复合材料[11]等，常作为固定化适配体的基材，复合纳米材料兼具几种组成材料的优点，有利于进一步提高传感器的性能，本实验将水滑石-金纳米粒子复合材料为固定化适配体的基材。

层状双金属氢氧化物（Layered double hydroxides，LDH）被称为类水滑石化合物，是由二价和三价金属离子组成的金属氢氧化物，及层与层间填充的阴离子而构成的一类无机层状化合物，具有离子交换性能好、表面积大、生物相容性良好等优点[12，13]。利用水滑石带正电荷的特点可以将带负电荷的核酸适配体静电吸附在其表面，进而将核酸适配体固定在电极上[14，15]。

金纳米粒子因其对生物分子具有良好的结合能力及其自身的高负载能力、较高的比表面积和催化活性，用它来构建生物传感器可提高灵敏度和稳定性，已被广泛应用于制备电化学生物传感器[16]。

鉴于以上物质特性，金纳米粒子具有比表面积大和导电性好的优点，对适配体的固载量和传感器的灵敏度均会有所提高。将金纳米粒子引入到水滑石中形成复合纳米材料，金纳米粒子一方面可提高复合材料的导电性，有利于电化学测试，另一方面可有效增大复合材料的比表面积，进而增大适配体的固载量。利用复合纳米材料中金纳米粒子的比表面积大和导电性好与水滑石由高的电荷密度而引起的强吸附性的协同作用，将大量适配体固定在电极表面，可有效提高传感器的性能。该复合纳米材料的制备方法有化学合成法[17～20]和电化学沉积法[21，22]两种，而用简单的一步法电化学沉积LDH-GNPs复合纳米材料，将其作为固定适配体的基质，在核酸适配体生物传感器中尚未见报道。

本实验采用一步法，在基础电极表面电化学合成制备CoAl LDH与GNPs的复合纳米材料，静电吸附核酸适配体后，以牛血清蛋白（BSA）封闭电极表面的空白位点，即可构建此生物传感器，最后采用电化学阻抗用于凝血酶的分析检测，传感器的检测原理示意图如图1所示。结果表明，采用本方法构建的传感器测定凝血酶，检出限低，稳定性良好。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

电化学工作站CHI660C（上海辰华仪器公司）；三电极体系（铂电极对电极， Ag/AgCl/KCl（饱和）参比电极，玻碳电极为工作电极）。JEM-2100型透射电子显微镜和 JSM-6701F型扫描电子显微镜（日本电子（JEOL）公司）。

凝血酶适配体（Apt，5′-HS-（CH2）6-CCA ACG GTT GGT GTG GTT GG-3′）[23]、凝血酶适配体互补序列（C-Apt，5′-CC AAC CAC ACC AAC CGT TGG-3′）和双酚A适配体（BPA-Apt，5′-CCG GTG GGT GGT CAG GTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3′），均购于生工生物工程（上海）有限公司；人的凝血酶（THR，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；牛的凝血酶（B-THR， 沈阳拜英生物技术有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，上海晶纯实业有限公司）；氯金酸（HAuCl4，上海试剂一厂）；辣根过氧化物酶（HRP，上海三杰生物技术有限公司）；腺苷（AD，Sigma Aldrich公司）；牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），使用时稀释50倍。

2.2 溶液的配制

凝血酶适配体序列为SELEX法筛选获得，凝血酶适配体以TE（20 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，1mmol/L EDTA，pH 7.4）缓冲溶液配成1 μmol/L的储备液[23]，于4℃保存。

各浓度凝血酶溶液及1 mg/mL牛血清蛋白溶液均以0.2 mol/L PBS缓冲溶液（pH 6.8）配制而成，于4℃保存。

2.3 修饰电极的制备

将玻碳电极（GCE）用0.05 μm Al2O3粉抛光，接着依次用无水乙醇和去离子水超声洗涤干净，再在0.5 mol/L H2SO4溶液中于 0.3～1.5 V下扫描活化。参照文献[21，24，25]，将预处理过的GCE于新配的0.03 mol/L Co（NO3）2、0.01 mol/L Al（NO3）3、0.3 mol/L KNO3、0.1 mol/L KCl和2 mmol/L HAuCl4混合液中，恒电位0.9 V条件下沉积60 s，即得金纳米粒子与水滑石的复合纳米材料，为GCE/LDH-GNPs。将此电极置于1 μmol/L 凝血酶适配体中12 h，1 mg/mL BSA中浸泡40 min，制得GCE/LDH-GNPs/Apt/BSA修饰电极。

GCE/LDH-GNPs修饰电极制备方法同上，将制好的电极用去离子水冲洗干净，于室温下晾干即可。用SEM表征。

2.4 电化学检测方法

对置于K3[Fe（CN）6]溶液中的GCE/LDH-GNPs/Apt/BSA修饰电极扫描，得到空白电阻（Ret0），洗净电极吹干后置于THR培养孵育40 min，再用电化学阻抗（EIS）扫描得到阻抗Ret，凝血酶的检测是基于传感器的阻抗响应ΔRet （ΔRet=Ret-Ret0）。

本实验的测定均采用三电极体系：电化学核酸适配体所组装的电极为工作电极，Ag/AgCl/KCl（饱和）作为参比电极，铂电极为对电极。实验过程均在室温25 ℃条件下进行。

在含0.1 mol/L KCl的5 mmol/L K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]（ 1∶1， V/V）溶液中测定得到交流阻抗谱（振幅：0.005 V，频率范围：1～100000 Hz），并通过ZSimpwin软件模拟而成。

3 结果与讨论

3.1 复合纳米材料的表征

采用扫描电镜和透射电镜对复合纳米材料进行形貌表征，从CoAl-LDH的SEM图（图2A）可以看到形状规则、分布均匀的水滑石颗粒[21]；从CoAl-LDH/GNPs复合纳米材料的SEM图（图2B）可以看到致密的粒子堆积在电极表面，而且将电极全部覆盖，还原后的Au纳米粒子与水滑石紧密结合在一起，与图2A形成鲜明对比；从CoAl-LDH/GNPs复合纳米材料的TEM图（图2C）可以看出金纳米粒子分散于水滑石基底上。

对钴铝水滑石复合材料进行了能谱（EDS）分析（图3）。从图3A可见，金元素和组成钴铝水滑石的元素峰均存在，每个元素所对应的出峰位置互不干扰，峰的强度也较大，说明所获得的即为LDH-GNPs。

3.2 修饰电极的循环伏安表征

为由修饰电极在0.5 mmol/L K3[Fe（CN）6]电解液中的CV曲线（图4）可见，在电解液中，不同的修饰电极呈现出不同的电化学行为。裸玻碳电极在0.2 V附近出现一对可逆性良好的氧化还原峰（曲线a）；沉积复合纳米材料后，氧化还原峰出现增大和偏移，这是由于GNPs有增大电流信号的作用，且LDH与电解液发生了氧化还原反应导致的（曲线b），电极反应方程式[26]：[Fe（CN）6]凝血酶适配体通过与LDH的静电吸附作用组装到电极表面后，电流信号下降（曲线c）；以牛血清蛋白封闭电极表面的空白位点，消除非特异性吸附，阻碍了电子传输，峰电流继续下降（曲线d）；在电极表面组装1.0 μg/L的凝血酶之后，阻碍了电子传递，使得电流减小（曲线e）。

3.3 不同电极的阻抗对比图

电化学阻抗技术能够敏感地感知电极界面性质的变化，在电化学检测方面的应用日益广泛[27]。本实验采用EIS对不同修饰电极LDH-GNPs的阻抗进行了比较，如图5所示，裸玻碳电极呈很小的半圆（曲线a）；单独沉积一层金后半圆减小，由于金纳米粒子具有促进电子传递的作用使得阻抗降低（曲线b）；沉积水滑石与纳米金的复合材料后阻抗略有增大（曲线c）；单独沉积一层水滑石，阻抗明显增大，这是因为水滑石不导电，阻碍了探针到电极表面的电子传递进而使得阻抗变大（曲线d）。

3.4 修饰电极的电化学阻抗表征

采用EIS对此修饰电极组装过程进行表征，如图6所示：裸电极呈现一个很小的半圆（曲线a）；当电沉积复合材料LDH-GNPs后，半圆直径增大，说明复合材料阻碍了[Fe（CN）6]3/4的电子传递，同时也说明复合材料成功聚合在电极表面（曲线b）；适配体组装到电极表面后，半圆直径明显增大，说明适配体通过静电吸附作用成功地组装到电极表面（曲线c）；利用BSA封闭电极表面的空白位点，其与电极结合后阻抗明显增大（曲线d）；最后凝血酶特异性地结合适配体后，半圆直径变大，说明凝血酶阻碍了电化学探针在电极表面反应（曲线e）。

3.5 传感器的性能

采用EIS对传感器在不同浓度的凝血酶中培育前后的阻抗变化进行研究，如图7所示，GCE/LDH-GNPs/Apt/BSA修饰电极的ΔRet对凝血酶浓度（1.0～1.0×105 ng/L）的对数lgc呈线性关系。线性方程为ΔRet（Ω）= 808.48+401.50lgc（ng/L），线性相关系数R=0.995，检出限为0.3 ng/L （S/N=3）。为了考察在水滑石中引入的金纳米粒子的作用，以单独的水滑石和金纳米粒子为基底材料制备了GCE/LDH/Apt/BSA和GCE/GNPs/Apt/BSA修饰电极。如图8和9所示，GCE/LDH/Apt/BSA修饰电极的ΔRet对凝血酶浓度（1.0～1.0×105 ng/L）的对数lgc呈线性关系。线性方程为：ΔRet（Ω）=377.63 +195.60 lgc（pg/mL）， 线性相关系数R=0.974。GCE/GNPs/Apt/BSA修饰电极修饰电极的ΔRet对凝血酶浓度（1.0～1.0×105 ng/L）的对数lgc呈线性 GCE/LDH/Apt/BSA和GCE/GNPs/Apt/BSA修饰电极的灵敏度远小于GCE/LDH-GNPs/Apt/BSA修饰电极的灵敏度，表明金纳米粒子与水滑石起到了很好的协同作用。

采用制备的适配体传感器与文献报道的适配体传感器，通过EIS法测定凝血酶，对其线性范围、检出限和适配体固定化方法等进行比较（表1）。结果表明，构建的适配体传感器的线性范围较大、检出限较低，这是由于具有大比表面积和导电性好的金纳米粒子和碳纳米管与强吸附作用的水滑石形成的复合纳米材料的协同作用，有效提高了传感器的性能。

3.6 干扰与稳定性

为了研究该传感器的抗干扰能力，以PBS （pH=6.8）分别配制THR（1.0 μg/L）、腺苷（AD， 10.0 μg/L）、辣根过氧化物酶（HRP，10.0 μg/L）、B-THR（10.0 μg/L）、C-Apt（10.0 μg/L）和KNO3（5 mmol/L），测定GCE/LDH-GNPs/Apt/BSA传感器的响应，以双酚A适配体取代凝血酶适配体制备的GCE/LDH-GNPs/BPA-Apt/BSA传感器测定1.0 μg/L THR的响应，进行干扰实验。从图10可见，C-Apt和B-THR有一定的干扰，其它物质的干扰较小，说明所制备的传感器具有较强的抗干扰能力。

对于LDH-GNPs修饰电极，在最佳实验条件下，在1.0 μg/L THR组装后用EIS测定10次，电化学阻抗的相对标准偏差为2.7%；此电化学核酸适配体吹干，于4℃保存1周后，传感器的响应信号保留值为94.0%，说明此传感器稳定性良好。同1根电极重复组装4次，测定1.0 μg/L THR，相对标准偏差为3.1%；采用4根不同的玻碳电极同时组装测定1.0 μg/L THR，其相对标准偏差为4.9%，说明此传感器重现性良好。

3.7 样品分析

为考察所设计的传感器的实用性与可靠性，以牛血清样品中的凝血酶对传感器进行了加标回收实验。如表2所示，对于LDH-GNPs修饰电极，回收率为90.0%～110.1%，相对标准偏差为2.4%～ 5.2%（n=3）。

4 结 论

采用电化学沉积法一步合成水滑石与金纳米粒子，并将复合纳米材料作为固定适配体的基质。结合金纳米粒子具有良好的导电性和较大的比表面积等优点，利用其与水滑石的协同作用，成功地将适配体固定在电极表面。以牛血清蛋白封闭电极表面的空白位点，消除非特异性吸附，成功构建了阻抗型生物传感器，并用于凝血酶的分析检测。结合扫描电镜技术，对材料的形貌进行了表征。利用电化学阻抗对传感器的性能进行了研究，LDH-GNPs修饰电极的ΔRet与凝血酶浓度（1.0 ng/L～100.0 μg/L）的对数lgc呈线性关系，线性相关系数R=0.995，检出限为0.3 ng/L（S/N=3）。结果表明，基于水滑石复合纳米材料构筑的阻抗型核酸适配体传感器对凝血酶有良好的信号响应，具有选择性高、检出限低和灵敏度高的优点。

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