人sTNFR1基因原核表达及体外抗肝细胞凋亡的活性研究

彭仕芳　傅　蕾　谭德明　候周华　刘洪波

摘要：采用RT-PCR，从Hela细胞的mRNA中扩增人STNFR1基因，构建含有目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆，转化入大肠杆菌，测序证实其序列与基因数据库中STNFRl基因一致，经异丙基，-β-D半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达，淀粉树脂亲和层析法纯化，得到融合蛋白STNFR1-MBP，结果显示：经Western-blotting检测，STNFR1-MBP具有免疫活性；流式细胞术检测目的蛋白对TNF-α诱导QSG7701凋亡有抑制作用，这为今后的研究打下了基础。

关键词：人STNFRl；原核表达；抗肝细胞调亡

中图分类号：R575.3

文献标识码：A

文章编号：1007-7847(2007)02-0147-06

肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor α，TNFα)是由单核，巨噬细胞分泌的具有多种生物学活性的细胞因子，能诱发肝细胞坏死和凋亡，其过度表达是肝功能衰竭发生发展过程中的一个重要因素，TNFα生物学作用通过特异性受体介导，而TNFα的可溶性受体(STNFR1)可中和TNFα的毒性作用，为有效抑制TNFα所诱发的细胞毒作用以及治疗肝功能衰竭，本研究从克隆STNFR1基因、构建原核表达质粒人手，获得了具有生物学活性的重组蛋白sTNFR1-MBP，为进一步研究该蛋白在肝功能衰竭的作用奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株、菌种与质粒

QSG7701人非致瘤性肝细胞株由中南大学湘雅医学院病理教研室所赠，JM109由我室保存，pGEM-T载体购自Promega公司，表达载体pMAL-c2x购自NEB公司。

1.1.2酶及主要试剂

TaqDNA聚合酶、rr4DNA连接酶、Sal I、EcoR I购自TakaRa公司，MMLV逆转录酶和WFG购自Promega公司，DNA凝胶纯化试剂盒购自QIA-GEN公司，淀粉树脂购自NEB公司，麦芽糖购自Sigma公司，Annexin-V-FITC凋亡检测试剂购自生物晶美公司，TNF-a、兔抗人STNFR1多克隆抗体购自PEPROTECH公司，Western blotting检测试剂盒购自博士德公司，TRIzol Reagent RNA分离液、DMEM(高糖)、新生牛血清购自美国GIBCOBRL公司产品，放线菌素-D购自北京夏斯生物公司，常用试剂为国产或进口分析纯。

1.1.3仪器

核苷酸测序使用ABl377全自动测序仪及配套的BigDye Terminator试剂盒测序，由博亚公司完成；流式细胞仪(FCM)为美国Becton Dickinson公司产品。

1.2方法

1.2.1 RT-PCR扩增sTNFR1目的片段

PCR引物参照人可溶性肿瘤坏死因子受体1(sTNFR1)cDNA全序列设计，由上海博亚公司合成，上下游引物5′分别加入Sa/I和EocR I酶切位点，上游引物：5′－GAA TCC ATG GAT AGTGTG TGT CCC C-3′；下游引物：5′-GTC GAC GGATCC TCA AAT GAT CAG GGG CAA C-3′，按TRI-zol说明书自Hela细胞中提取总RNA作为逆转录模板，采用RT-PCR方法扩增sTNFR1基因，逆转录反应条件参照MMLV逆转酶说明书进行：取总RNA 3μg，oligo(18)0.5μg，加DEPC水至总体积12μL，70℃5 min后，立即置于冰上；然后加入5xRT Buffer 5μL，dNTP 12.5 nmol，RNA酶抑制剂25U，MMLV逆转录酶200 U，加DEPC水至总体积25μL，42℃60 min逆转录，逆转录后产物为cDNA，PCR反应体系为DNA2μL。TaqDNA聚合酶0.5u，10xBuffer(Mg2+)5L，10mmol/L dNTP34μL，人sTNFR1引物各25pmo1，加双蒸水至总体积50μL l.PCR条件：95℃5min预变性，94℃40 s变性，55 qC 40 s退火，72℃lmin延伸，32个循环后，72℃延伸15min，

1.2.2构建原核表达质粒

PCR产物纯化后，首先应用T载体克隆，然后从重组的“T”质粒DNA中，应用Sal I、EocR I双酶切出sTNFR1基因片段，与用相同酶切后的pMAL-c2x质粒DNA连接重组，转入感受态细菌JM109，挑取阳性克隆，接种于含有100mg／L氨苄青霉素的LB培养过夜生长，提取质粒，Sal I和EocR I双酶切分析，并且核苷酸测序证实。

1.2.3 重组蛋白的诱导表达及条件优化

挑选经测序验证的阳性克隆菌放入含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中振荡培养，用异丙基β－D－半乳糖苷酶(IPTG)诱导重组蛋白的表达，参照文献[7]找出重组蛋白最佳的表达条件：26℃，0.06 mmol/L IPIG，200r/min，将转化菌在含有100mg/L氨苄青霉素的LB中过夜生长，次日以1：100接种于含100mg/L氨苄青霉素的LB，37℃振荡生长至吸光度值A600=0.5，加IPTG至0.06 mmol/L.26℃继续振荡6h，离心收集诱导后的菌体，超声裂解细菌，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达的重组蛋白。

1.2.4重组蛋白的纯化

取200～500mL含有100mg／L氨苄青霉素的LB培养基增菌后，在最佳表达条件下诱导表达，收集菌体超声破碎细菌，5000g离心30min，收集上清，将上清以1：4比例稀释上淀粉树脂层析柱，并用10mmol/L麦芽糖洗脱融合蛋白，将所得纯化蛋白SDS-PAGE分析。

1.2.5 Western-blotting检测重组蛋白

全菌体裂解液经SDS-PAGE分离后，转移到PVDF膜上(同时有空菌和空质粒作为对照)，4℃转移电泳70rain，100V恒压，转膜完毕经丽春红染色可见有目的蛋白条带，TBS洗涤两次，用含5％脱脂奶粉的TBST37℃封闭1h，将PVDF膜与兔抗人STNFR1多克隆抗体(浓度0.1mg/L)温育2h，TBST洗涤5minx3后，与HRP标记的羊抗兔IgG(1：3000)室温孵育1h，TBS洗涤10minx3，0.1mL/cm2量加ECL发光试剂，暗室内曝光x光胶片，常规方法显影、定影。

1.2.6重组蛋白抗凋亡的体外实验

1)TNF-a诱导QSG7701细胞凋亡，检测重组蛋白STNFR1-MBP抗凋亡作用，QSG7701细胞按

2x10/mL的浓度接种6孔板中续养，待细胞生长至90％-95％满，备用，STNFR1-MBP 40mg/L与10μ/L的TNF-α4℃反应2h，再加入QSG7701细胞培基中，并加入1mg/L放线菌素D；设MBP为对照组(加MBP、TNF-a和放线菌素D)以及正常组(只有QSG7701细胞，不加TNF-α和放线菌素D)，每组设3个复孔，在37℃，5％CO2及饱和湿度条件下，培养6h收集细胞。

2)Anexin－V－FITC染色：a)将待测细胞用0.25％胰酶消化，制成单个悬液，调整细胞密度为0.5～1×106/L；b1取1 mL细胞，1000r/min 4℃离心10min；c)加入1mL冷的PBS，轻轻振荡使细胞悬浮；d)1000r/min 4℃离心10 min，弃上清液；e)重复步骤c)、d)两次；f)用去离子水按1：4稀释结合缓冲液，将细胞重悬于250μL结合缓冲液，并使其浓度为lx106/L；g)取100μL的细胞悬液于5mL流式管中，加入μL Annexin-V-FITC和10μ20mg/L的PI，轻轻混匀，避光室温反应15min；h)加入400μL结合缓冲液，立即上机(流式细胞仪)检测，光源为488 nm的氩离子激光器，FITC受激发后发绿色荧光，PI发红色荧光。

2 结果

2.1STNFR1基因片段纯化和pMAL-c2x-STN-FR1重组表达质粒的构建

从Hela细胞的mRNA中通过RT-PCR成功地扩增了558bp大小的基因片段，通过基因重组技术得到阳性克隆，并经酶切分析和DNA测序证实获得了含有STNFRl基因片段的人重组pMAL-c2X-STNFR1克隆。

2.2重组蛋白的表达与纯化

将重组基因工程菌经IPTG诱导后对全菌裂解液进行SDS-PAGE分析，在相对分子质量的为66 kD处出现对照菌没有的一条粗蛋白带，与STNFR1融合蛋白相对分子质量一致，经IPTG诱导的重组基因工程菌，超声波裂解后用淀粉树脂亲和层析法分离纯化，得到了高纯度的重组融合蛋白。

2.3 Western-blotting检测重组蛋白

将转移到PVDF膜上的STNFR1重组蛋白与兔抗人STNFR1多克隆抗体反应后，与酶标记的羊抗兔IgG反应后，ECL显色，曝光，胶片上可见一条带，其位置与目的蛋白带一致，而对照菌JM109及pMAL-c2x/JM109均未见显色反应。

2.4重组蛋白抗凋亡的体外实验

流式细胞仪分析，获得4个象限的直方图，每个象限的细胞数目就是在检测细胞总数所在点的组分，左下象限代表正常细胞(An-PI-)，右下象限代表早期凋亡细胞(An+PI-)，右上象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞(An+PI+)，左上象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞(An-PI+)，可见STNFR1，MBP组凋亡率低于对照组，有显著性差异(P0.05)。

3讨论

大量研究表明，肿瘤坏死因子α(tumor necro-sis factors，TNFα)所诱导的肝细胞凋亡在肝功能衰竭的发生发展中起着重要作用，TNFα生物学功能是通过与细胞表面膜受体(TNFR1和TN-FR2)的结合来实现的，可溶性TNFR(sTNFR)游离在血液中，它可与TNFa结合，但无法介导TN-Fet的信号传导，从而可拮抗TNFα的生理作用，有研究表明，们，血浆STNFRl水平随TNFa水平升高而升高，但其水平相对于TNFa水平是不足的，因此，应用STNFR1抑制TNFα所诱导的肝细胞凋亡，在治疗肝功能衰竭中有着潜在的重要意义，这一点在其他疾病中也得到证实，尽管sTNFR1属内源性物质，但从体液中直接提取sTNFR1的量有限，难以满足临床治疗的需要，利用基因工程的方法生产sTNFR1有深远的研究和应用价值。

本研究从人Hela细胞提取总RNA，通过RT-PCR获得sTNFR1全编码的基因，构建了重组质粒pMAL-c2x-sTNFR1亚克隆，经酶切及核苷酸测序，证实获得pMAL-c2x，STNFR1重组基因工程菌，与Loetscher等报告的序列比较，结果完全一致，无移码突变，STNFR1序列正确地插入到了MBP序列之后保证了STNFR1蛋白的正确表达，真白在原核细胞中表达面临一个问题，就是它可能会被原核细胞中的蛋白酶识别降解，采用融合蛋白表达可解决这一问题，本实验采取的oMAL-c2x是在大肠杆菌中克隆的融合蛋白表达载体，其含有大肠杆菌malE基因，编码麦芽糖蛋白(MBP)，在malE和LaZα之间含有多克隆位点，克隆的基因插入malE下游，通过强启动分子tac和malE翻译的起始信号产生克隆基因的高效表达，由于其白与上游的原白MBP融合，起到了有效的保护作用，且可通过淀粉树脂醇亲和层析法纯化MBP融合蛋白，经IPTG诱导，目的基因在大肠杆菌JM109中表达，经SDS・PAGE蛋白电泳检测诱导情况，发现诱导的含pMAL-c2x空载体的JM109菌在43 kD位置有一蛋白带，这是空载体产生的MBP蛋白带，诱导的含重组质粒的JM109在66 kD处出现一蛋白带，而JM109宿主菌、未诱导pMAL-c2x空质粒的JM109和未诱导的重组质粒转化JM109菌均无此带，证明此蛋白的出现是由带有sTNFR1基因片段的重组表达质粒表达的融合蛋白，而且该蛋白的相对分子质量与目的融合蛋白预计的相对分子质量一致，经Western-blotting鉴定，该蛋白能与sTNFR1特异性抗体起结合，证实该蛋白具有sTNFR1的免疫活性，因此证明本研究已成功的克隆表达出sTNFR1-MBP融合蛋白并进一步得到了高纯度的sTNFR-MBP。

TNF-α对正常肝细胞无明显毒性作用，只有与氨基半乳糖和放线菌素D等合用才显示出明显的毒性作用，放线菌素D一方面可抑制TNF，α诱导产生的两种保护性蛋白质(P39和P42)：另一方面可诱导细胞凋亡所需蛋白质的转译，参与肝细胞凋亡的发生，本研究采取TNF-α和放线菌素D诱导肝细胞坏死，应用以荧光素FITC标记Annexin―V作为探针，利用流式细胞仪检测细胞凋亡，观察sTNFR1-MBP对抗TNF-α诱导QSG7701细胞的细胞凋亡作用，研究结果示sTNFR1-MBP组凋亡率为22.62+1.22％，低于对照组70.50+4.74％，有显著性差异(P