鲎试剂用于微生物限度的快速检验

[摘要]目的：探讨鲎试剂用于微生物限度快速检验的可行性。方法：应用鲎试剂（TAL Reagent）测定其对革兰阴性菌（G-菌）体的灵敏度，对51批液体制剂进行检验，比较鲎试剂法与法定方法的符合程度。结果：两种方法结果符合率为94.1%。结论：鲎试剂法操作简便、快速、灵敏，适用于90%以上的医院液体制剂检查。

[关键词]微生物限度；鲎试剂法；快速检验

[中图分类号]R927[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2007）03（c）-119-02

微生物限度检查是控制药品质量的重要卫生学指标，法定的方法操作繁琐，需要的仪器、试剂多，检验周期长。近来，我们对本区域内医院用普通液体制剂的微生物限度进行了考察，316批样品中细菌项不合格的为18批，霉菌项不合格的为3批，致病菌未检出，总合格率为93.4%，其中细菌项合格率为94.3%，霉菌项合格率为99.1%。据文献报道[1，2]，水中的微生物很多，但98%污染的是革兰阴性菌，蒸馏水污染的菌群，通常也是革兰阴性菌，而致病菌和非致病菌的G-菌都含有内毒素。笔者探讨了用鲎试剂测定样品含菌量的快速检验方法，现报道如下：

1 试剂与仪器

营养肉汤培养基，伊红美蓝琼脂培养基，鲎试剂（灵敏度：0.25 EU/ml；批号：980210，湛江海洋生物制品厂），细菌内毒素工作标准（规格：1 000 EU/支；批号：980227，中国药品生物制品检定所），CMCC（B）44102大肠杆菌菌种（山东省药品检验所提供），菌落计数器，生物显微镜，恒温干燥箱，生化培养箱，具塞试管，培养皿。

2 试验方法及样品处理

2.1 法定方法

按中国药典2000年版二部附录92页XIJ微生物限度法和中国药典2005年版二部附录70页ⅧC微生物限度检查法操作。

2.2 鲎试剂法

按照中国药典2000年版二部附录86页XIE细菌内毒素法和中国药典2005年版二部附录79页ⅧD细菌内毒素检查法操作。

2.3 鲎试剂法的样品处理

取医院用普通液体制剂样品，每次实验时从两个以上的包装中取样品10 ml于除热原的试管中，水浴煮沸5 min灭活，使G-菌释放出内毒素，冷却后稀释成10-1、10-2、10-3浓度备用。

3 鲎试剂对G-菌菌体的灵敏度测定

3.1 标准菌液的确定

取大肠杆菌新鲜培养物1白金饵至40 ml灭菌的营养肉汤培养基中，摇匀，36℃培养18 h，用内毒素检查合格的0.9%氯化钠做10倍递增稀释至10-5、10-6、10-7浓度。以10-6浓度为试验浓度，取9只平皿，每只平皿中加入1/3 ml-1菌液，然后各加入冷却至50℃以下的伊红美蓝琼脂培养基15 ml，摇匀，待其凝固后放入35℃生化培养箱中培养48 h，进行菌落计数，并经反复试验使含菌数在100个/ml左右，此菌液为标准菌液。

3.2 用鲎试剂法测定标准菌液的灵敏度

取标准菌液10 ml于试管中，经灭活处理后用10杯水递增稀释成每毫升含菌数102、101、100、10-1、10-2浓度，分别用鲎试剂法测定，每个浓度用4支试管，结果见表1。

中国药典2000年版二部规定：样品符合规定指样品含菌数≤100个/ml；不符合规定指样品含菌数＞100个/ml；鲎试剂法是以样品与反应呈阳性（+）为不符合规定，呈阴性（-）为符合规定

4 样品的微生物限度测定

取51批液体制剂分别按上述检验标准与操作方法进行试验，结果见表2。

5 讨论

5.1 两种方法比较

鲎试剂法操作简便、快速、灵敏，与法定方法符合率高。按法定方法检查操作繁琐，检验周期需要2～3 d，鲎试剂法操作简便，检验1次需要1～2 h，比较适合医院制剂室人员操作。从表2中51批样品的检验结果看，鲎试剂法与法定方法检验结果符合的为48批次，不符合的为3批次，符合率为94.1%。故鲎试剂法可用于90%以上的普通溶液制剂的微生物限度检查。

5.2 鲎试剂法可作为普通溶液剂含菌量的限度检查

中国药典2000年版一部、二部都规定：口服、外用溶液剂微生物限度不得超过100个/ml。用鲎试剂法测定，只需将样品稀释成10-2、10-3浓度，如果该浓度与鲎试剂反应均呈阴性或10-2反应呈阳性，而10-3反应呈阴性，则该样品的含菌量小于100个/ml，符合规定；如果该浓度与鲎试剂反应均呈阳性，则该样品的含菌量超过100个/ml，不符合规定。

5.3 鲎试剂法可作为普通溶液剂含菌量的定量测定

欲求某个样品每毫升的含菌数，可将样品按10倍递增稀释成10-1、10-2、10-3……浓度，分别与鲎试剂反应，以最后出现阳性管的稀释级为准，按10n-1(n为终点管的稀释级数)计算样品的含菌数量。

5.4 样品液的pH值、成分对本法的影响

有些制剂如胃蛋白酶合剂、硫酸镁合剂、颠茄合剂及部分中药制剂，由于pH值低，含盐量高，含生物碱、皂苷等原因，对10-1浓度与鲎试剂反应有影响，出现干扰作用，而10-2、10-3浓度与鲎试剂反应则完全可以消除此干扰现象。

5.5 其他情况

除了溶液剂以外，其他液体制剂如糖浆剂、乳剂、混悬剂等，经适当方法处理后也适用于本法。

[参考文献]

[1]郑均镛，王光宝.药品微生物学及检验技术[M].北京：人民卫生出版社，1989.391，392.

[2]周海均.热原的本质及鲎试剂的进展[J].药学通报，1988，23（5）：276.

（收稿日期：2007-01-30）